第四章
讨 论
第一节 以 遗传工程技术研究微量蛇毒蛋白
传统的蛇毒研究都是利用生化分离技术,先纯化出於蛇毒液中含 量较多且具有药理活性的成分来做研究 (Lee, 1979),但是对於一些 微量的蛇毒蛋白,即使投下大量人力及物力,也不易取得足够量的毒 蛋白来做分析研究,所以传统蛇毒研究法已无法适用於微量蛇毒蛋白 的研究 (Grismer et al., 1994).因此本实验室一直致力探讨如何从分 子层面来制备微量蛇毒蛋白,希望利用分子生物学的技术,先取得全 长的蛇毒蛋白基因,经核苷酸定序及电脑分析比对后,推论此蛋白基 因可能具有的生物活性,进一步用於制备及纯化出大量且高纯度的蛇 毒蛋白,经由再折叠恢复生物活性,再探究其药理功能与作用机转. 在去年实验室的何佩勋学姊已经成功的由大肠杆菌表达台湾龟壳花 毒蛇中的 disintegrin 重组蛋白再折叠成有生物活性的蛋白质,并将 之命名为 trimucrin (何佩勋, 2000).恢复生物活性的 trimucrin 可以 对胶原蛋白 (collagen) 引起的血小板凝集现象产生抑制作用.接下 来本篇论文希望达成的目标是探讨恢复生物活性的 trimucrin 是否 和其它 disintegrin 一样除了对有抑制血小板凝集的能力外,也有抑 制血管增生的作用 (Gould and Friedman, 1990).
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第二节 体内外模式的血管增生抑制作用
Matrigel 是一种由 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma 肿瘤细胞所分泌,富含有各种促进血管增生因子的细胞外基 质,来作为实验材料.此一 Matrigel 在 4℃ 时为液态,37℃ 下为 凝胶状态,可提供三度空间环境,便於内皮细胞分化成类似新微血管 网状的管腔,而模拟血管增生作用的过程 (Kleinman et al., 1986 ) . 利用显微照像技术发现,trimucrin 可呈剂量相关性地抑制培养在 Matrigel 的主动脉环周边生成管状的内皮细胞长成作用,而不含 trimucrin 的控制组则否.在活体实验方面,则是利用 10 天大之鸡胚 胎绒毛膜尿囊模式来研究自发性的血管增成.经过 48 小时的培养发 现,只有由 bFGF 引起血管增生作用才可以被 trimucrin 所抑制.根 据之前学者的实验证实 disintegrin 可以抑制血管增生成主要是透过 与内皮细胞细胞模上的 αvβ3 黏著分子作用,导致内皮细胞走向细胞 凋亡 (apoptosis) 的结果 (Yeh et al., 1998).而 αvβ3 是透过 bFGF 才能表现出来的细胞黏著受体 (Klein et al., 1993).由此结果推测 trimucrin 抑制血管增生可能是与内皮细胞细胞模上的 αvβ3 作用的 结果.将来实验设计应可针内皮细胞细胞膜上的黏著分子,利用流式 细胞仪 (flow cytometry) 分析 FITC-trimucrin 与内皮细胞上的黏著 分子结合的情形,来探讨 trimucrin 是否透过与 αvβ3 作用而抑制血
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管增生并且观察 trimucrin 是否也促使表达 αvβ3 的内皮细胞走向细 胞凋亡.
第三节 肿瘤生长抑制实验
抑制血管增生可成为治愈肿瘤的新疗法的观念最早是由 Folkman 首先提出的理论 (Folkman, 1971).他认为, 「一旦肿瘤产 生,任何肿瘤细胞族群大小的增加,则必有血管增生的集中增加现 象」 .许多实验已证实,肿瘤细胞的生长与转移,是有赖於血管增生 作用的.而本次实验中观察到 trimucrin 可以减缓裸鼠背部肿瘤的生 长速率,但是效果却不如 thalidomide. 「沙利窦迈」(thalidomide) 是 一种最早被广泛使用为镇静剂及预防妊娠性呕吐的药物,但却造成 欧,美,加,日等地区发生一万多名怀孕妇女产下畸型胎之悲剧, 从此 thalidomide 便在临床上消声匿迹,且欧美日,包括台湾在内已 将之列为禁药.但是近年来发现 thalidomide 对血管增生有抑制的效 果.经实验证实它可以抑制由 VEGF 或 bFGF 引起的血管增生作 用,但是其作用的机转并不清楚 (Politi, 2000).虽然在本次的实验中 thalidomide 虽然有抑制胃癌细胞株 (TMC-1) 的生长的现象 但是肿 , 瘤的中间部位却有细胞坏死的情况.而这个现象可能是血管增生的 过程被抑制住,使的肿瘤靠中心的部位无法获得足够的养分造成 的.合并 thalidomide 及 trimucrin 的实验结果呈现出显著的肿瘤生

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