实验一 蛋白质含量测定
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法.了解各种测定方法的基本原 理和优缺点. 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用,最基本的分析方法之一.目前 常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret 法) ,Folin-酚试剂 法(Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法, 即考马斯亮蓝法(Bradford 法) .其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高,比紫外 吸收法灵敏 10～20 倍,比 Biuret 法灵敏 100 倍以上.定氮法虽然比较复杂,但较 准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质. 值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质, 因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果.每种测定法 都不是完美无缺的,都有其优缺点.在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的 灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的 时间. 考马斯亮蓝法(Bradford 法) ,由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用. 一,微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热.含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成 硫酸氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和 的程度可计算得样品之氮含量.若以甘氨酸为例,其反应式如下: CH2COOH
| NH2 + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2H2O +Na2SO4 + 2NH3
(2) (3)
反应(1) ,(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行. 为了加速消化,可以加入 CuSO4 作催化剂,K2SO4 以提高溶液的沸点.收集氨可 用硼酸溶液,滴定则用强酸.实验和计算方法这里从略. 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋
白氮即得.如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以 6.25 即 得.
五种蛋白质测定方法比较如下: 方法 凯氏定氮法 (Kjedahl 法 ) 灵敏度 时间 原理 将蛋白氮转化 为氨,用酸吸 收后滴定 干扰物质 非 蛋 白 氮 (可用三氯 乙酸沉淀蛋 白 质 而 分 离) 硫 酸 铵 ; Tris 缓 冲 液;某些氨 基酸 各种嘌吟和 嘧啶; 各种核苷酸 硫酸铵; Tris 缓 冲 液; 甘氨酸; 各种硫醇 强碱性缓冲 液; TritonX100; SDS 说明 用于标准蛋白 质含量的准确 测定;干扰少; 费时太长 用于快速测 定,但不太灵 敏;不同蛋白 质显色相似 用于层析 柱流出液的检 测;核酸的吸 收可以校正 耗费时间长; 操作要严格计 时; 颜色深浅随不 同蛋白质变化 最好的方法; 干扰物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不 同蛋白质变化
灵敏度低, 费 时 适用于 0.2~ 8-10 1.0mg 氮, 误 小时 差为 ±2% 中 速 20~30 分钟 快速 5 ～ 10 分钟 慢 速 40 ～ 60 分 钟 快速 5 ～ 15 分钟
双缩 脲 法 灵敏度低 (Biuret 法) 1～20mg
多肽键+碱性 Cu2 + → 紫 色 络合物 蛋白质中的酪 氨酸和色氨酸 残 基 在 280nm 处的光吸收 双缩脲反 应;磷钼酸- 磷钨酸试剂被 Tyr 和 Phe 还原 考马斯亮蓝染 料与蛋白质结 合时,其λmax 由 465nm 变为 595nm
紫外吸收法
较为灵敏 50～100μg
Folin - 酚 灵敏度高 试 剂 法 ～5μg (Lowry 法)
考马斯亮蓝 法 (Bradford 法)
灵敏度最高 1～5μg
二,双缩脲法(Biuret 法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子脲经 180℃左右加热,放出一个分子氨后 得到的产物.在强碱性溶液中,双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应. 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这 类化合物都有双缩脲反应.
H2O O=C HN R-CH O=C HN R-CH H2O 紫色络合物 Cu NH CH-R C=O NH CH-R C=O
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸 成分无关,故可用来测定蛋白质含量.测定范围为 1~10mg 蛋白质.干扰这一测定的 物质主要有:硫酸铵,Tris 缓冲液和某些氨基酸等. 此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质 少.主要的缺点是灵敏度差.因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确 的蛋白质测定. (二)试剂与器材 1. 试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配 制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液, 可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其纯度. 如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度, 再根据其纯度, 称量配制成标准蛋白质溶液. 牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制, 酪蛋白用 0.05N NaOH 配制. (2)双缩脲试剂:称以 1.50 克硫酸铜(CuSO45H2O)和 6.0 克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O64H2O) ,用 500 毫升水溶解,在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液, 用水稀释到 1 升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中) .此试剂可长期保存. 若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制. 2. 器材: 可见光分光光度计,大试管 15 支,旋涡混合器等. (三)操作方法 1. 标准曲线的测定: 12 支试管分两组, 取 分别加入 0, 0.4, 0.2, 0.6, 0.8, 1.0

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