实验室各研究方向的主要研究进展
(1)作物脱毒快繁方向
a,梨病毒脱除技术研究
采用恒温热处理,变温热处理与茎尖培养相结合,研究比较了不同处理条件对2个砂梨品种离体植株生长增殖及脱病毒效果的影响.
1)热处理对砂梨离体植株的存活及增殖的影响.采用37℃恒温和32℃/37℃变温分别对132株和117 株丰水梨离体培养植株进行了处理,结果表明37℃恒温处理对这些植株的生长有明显的影响,10天后叶片开始褐化,顶端枯死;15天后,部分植株死亡;至35天时,仅14.2%存活.32℃/37℃变温处理对离体植株生长的影响相对较小,至第25天仅少数植株死亡(死亡率为0.9%)至第50天存活率仍在68%以上. 不同温度处理对该离体植株的增殖影响也有明显的差异,恒温热处理植株的增殖系数明显降低,而变温处理的增殖系数与未处理植株无明显的差异.
2)热处理对砂梨离体植株增高的影响.37℃恒温处理对植株的生长具有明显的抑制作用, 热处理35天后,丰水梨和黄花梨的株高均无明显变化.而32/37℃变温热处理在最初30天内对植株最高有一定的抑制作用,表现为处理植株较对照矮;30天以后,处理植株的生长明显加快,至第50天时处理植株最高约3.5倍,较对照植株高.
3)热处理对梨茎尖病毒浓度的影响及病毒脱除效果.热处理不同时期后,分别取1mm,2mm和5mm的茎尖进行再培养,继代2次后,采用ELISA法对各处理后获得的离体植株进行检测,分析其病毒相对浓度.两种热处理方法对梨茎尖中病毒浓度的影响呈现相似的趋势,即随处理时间的延长,ACLSV和ASGV在茎尖中的浓度降低(吸光值减小),同一植株中,离茎尖愈近病毒浓度愈低.恒温热处理达35天时,取1mm茎尖培养植株的ELISA检测吸光值与阴性对照相近.变温热处理至45天时,两种病毒的ELISA检测吸光值均明显降低,至50天时取1mm茎尖培养植株的ELISA检测吸光值与阴性对照相近.这种病毒浓度降低趋势与变温热处理过程中植株的快速增高呈正相关.
采用已建立的Dot-blot 杂交法对这些热处理获得黄花离体植株的带病毒状况进行了验证,结果表明ELISA和Dot-blot 杂交法检测各植株中两种病毒浓度变化呈现相似的趋势.
恒温热处理和变温热处理不同时期取不同大小茎尖再培养后获得的'丰水梨'离体植株经继代培养2-3次后,根据ELISA检测结果,其脱除ACLSV和ASGV的效果显示,恒温热处理30天后取1mm大小的茎尖再培养获得植株,ACLSV检测结果呈阴性;恒温热处理35天后,1mm大小的茎尖再培养获得植株ACLSV和ASGV检测结果均呈阴性, 2mm茎尖再培养获得植株ACLSV检测结果也呈阴性.这些结果表明,在相同的处理条件下,ASGV热稳定性较强,更难脱除.变温热处理40天后,取1mm茎尖培养,部分植株ACLSV和ASGV的ELISA检测结果呈阴性;至45天后,取1mm,2mm和5mm茎尖所获植株ACLSV和ASGV的ELISA检测结果均呈阴性.这些病毒检测呈阴性植株的带毒状况将进一步采用斑点杂交进行验证.
'黄花梨'恒温热处理不同时期后,取不同大小茎尖所获离体植株,经ELISA和斑点杂交检测结果如下表.热处理35天后,取1mm茎尖培养,来源于主芽的3株中2株脱除了ACLSV,1株脱除了ASGV,来源于侧芽的2株中1株脱除ACLSV,未能脱除ASGV; 热处理35天后,取2mm和5mm茎尖培养, 来源于主芽的植株有1/3脱除了ACLSV,未能脱除ASGV.
b,柑橘黄龙病菌分子鉴定及与其混合发生的几种病毒分子检测技术研究
柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是世界性柑橘生产上的毁灭性病害.易与其混合发生的几种柑橘病毒病及类似病害主要包括衰退病,裂皮病和碎叶病;病原分别为Citrus tristeza virus (CTV), Citrus exocortis viroid (CEVd), Citrus tatter leaf virus (CTLV).本研究主要以HLB病菌,CTV,CEVd,CTLV为对象,从生物学角度及分子水平上对其部分特性进行研究;目的是建立上述4种病原的高灵敏度的分子检测技术体系;在分子水平上明确其部分分子特性.另外初步探讨运用超低温技术脱除HLB病菌,CTV,CEVd的可能性及机理.
1) HLB病菌生物学鉴定及PCR检测体系优化.以长春花和椪柑为指示植物,部分待检材料表现了明显HLB症状.通过对影响PCR技术的各个主要因素的调整,建立了HLB病菌 PCR,Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测技术;并对三种方法的检测灵敏度进行比较,结果发现Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测灵敏度远高于常规PCR,是常规PCR的104倍.运用Nested-PCR技术在黄皮上检测出HLB病菌(Candidatus Liberobacter asiaticus),在国内外属于首次报道.

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