中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(2):49～52
毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）克隆、序列分析
及其植物表达载体的构建*
李春秀1，2齐力旺1王建华1张守攻1**
（1 中国林业科学研究院林业研究所细胞生物学实验室北京100091)
(2 四川农业大学林学园艺学院雅安625014）
摘要以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1），序列分析表明该基因序列为3215bp, 与欧洲颤杨的PtCesA1基因同源性为97% 具有开放的阅读框，编码区在52~2985碱基之间，编码区为2925bp。通过同义突变引入BamHI酶切位点，将全长基因克隆到植物表达载体pBI121中，经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确，为下一步ptoCesA1转基因功能研究打下了基础。
关键词毛白杨纤维素合成酶基因植物表达载体
中图分类号Q785
收稿日期：20050519修回日期：20051114
* 国家“863”计划资助项目(2003AA244060)，(2003AA244020)
** 通讯作者，电子信箱：shougong.zhang@ caf.ac.cn纤维素合成酶基因PtrCesA1基因是从欧洲颤杨中克隆到的第一个林木纤维素合成酶基因［1］，研究表明该基因主要在茎部表达，表达的高峰在次生壁形成期，推测该基因的功能与次生壁的形成相关，但并没有对其进行转基因的功能鉴定。本研究以毛白杨为材料克隆得到了PtrCesA1的同源基因毛白杨纤维素合成酶基因PtoCesA1，并构建了植物表达载体，为研究其精细功能打下了基础。
1材料和方法1.1实验材料
植物材料三年生毛白杨（Populus tomentosa）(本课题组提供)；植物表达载体pBI121（中国林业科学院林业研究所生物技术室提供）；pGETT载体（Promega ），RNase A (Takara)、Taq DNA聚合酶（鼎国生物技术公司，Promega）；IPTG、Xgal、氨苄青霉素、卡那霉素、羧苄青霉素（Promega）。cDNA合成试剂盒（Clontech）Triziol RNA提取试剂盒（Invitrogion）。所有引物在赛百盛公司合成，DNA测序（上海联合基因公司）。
1.2毛白杨茎RNA的提取
取毛白杨2年生枝条的次生木质部［2］，迅速放入液氮中研磨成粉末状，按照Invitrogion公司Triziol试剂盒的操作纯化RNA。
1.3毛白杨双链cDNA的合成
毛白杨双链cDNA的合成采用的是Clontech公司的Smart cDNA Library Construction Kit.，严格按照该流程操作。
1.4基因的克隆与测序
根据Genbank已发表的欧洲颤杨纤维素合成酶基因PtrcesA1序列，利用DNAstar和Primer和Primer设计引物：PA1FF:5′GTCGACCCACGCGTCCGTCTTGAAAG
AATA3′PA1FR:5′CCCCAAAATACTGGGAGAGACTTA
TTGGAG3′，以毛白杨的双链cDNA为模板进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性5min，94℃ 30s，68℃3min 35个循环，72℃延伸7 min。回收PCR产物，按照PGEMT easy载体试剂盒操作流程，将回收的DNA片段连接到T载体上，转化大肠杆菌DHα菌株，蓝白斑筛选，质粒提取，酶切鉴定片段大小后测序。
1.5植物表达载体的构建
cDNA的PCR扩增，PCR产物的回收，连接，酶切，感受态细胞制备，质粒DNA的提取，连接、转化以及琼脂糖凝胶电泳分析均按文献［3］进行，构建的植物表达载体命名为pBIPA1。
2结果与分析2.1毛白杨双链cDNA的合成
用Invitrigion公司Triziol试剂盒提取的RNA的电泳图，主带清晰完整，D260/ D280比值达2.0, RNA浓度为25μg/μl，说明RNA纯度和浓度高，可以用于合成双链cDNA.。取上述RNA用SMART cDNA library construction kit合成双链cDNA, 合成产物在0.8%的琼脂糖胶中电泳， 电泳图（图1）呈现500bp到4000bp的一条弥散的亮带，符合植物双链cDNA的带谱特点。
2006, 26(2)李春秀 等：毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）克隆、序列分析及其植物表达载体的构建
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006