图1毛白杨cDNA的合成
Fig. 1Double strand cDNA synthesis of secondary
xylem of Chinese white poplar
2.2毛白杨PtoCesA1基因的克隆
以毛白杨双链cDNA为模板，以(PA1FF,PA1FR)图2毛白杨PtoCesA1基因的克隆
Fig. 2Cloning of PtoCesA1 fragment from secondary
xylem cDNA of Chinese white poplar
为引物进行PCR，产物在0.1%的胶中电泳，经EB染色，在3000bp左右大小处有一条亮带（图2），测序结果表明该基因片段为3215bp, 将它与欧洲颤杨的PtCesA1基因进行同源性比较，同源性为97%。具有开放的阅读框，编码区在52~2988碱基之间，编码区为2925bp，推测编码975个氨基酸，将其与典型的植物纤维素合成酶基因进行比较［4］，其结构有如下特点，具有纤维素合成酶共有的保守区D，D，DQXXRW保守区， 4个植物纤维素合成酶所特有的保守区CRP，2个植物纤维素合成酶基因所特有的高变区， 8 个跨膜区（图3），确认3215bp的DNA片段为毛白杨的一个全长纤维素合成酶基因，命名为PtoCesA1基因Genbank的注册号为DQ004570 。
图3PtoCesA1纤维素合成酶的结构
Fig. 3Structure of PtoCesA1 proteins2.3PtoCesA1基因正义植物表达载体的构建
植物表达载体pBI121的可用酶切位点有SacI，BamHI，XbaI，通过分析PtoCesA1全长基因的酶切位点，在其前半部有一个SacI酶切位点，因此可用酶切位点为BamHI，XbaI，但如果利用BamHI，XbaI酶切位点构建表达载体，将不能切除GUS基因，整个植物表达载体太大，不利于下一步的遗传转化。因此本实验采取了如下策略将全长基因克隆到植物表达载体中。首先利用同义突变设计引物引入BamHI酶切位点（图4 ），从编码区的第一个碱基开始计数，在1772 至1728的碱基序列与BamHI的碱基序列只相差一个碱基，即1722位的碱基A，它在编码氨基酸的密码子中正好为第3个碱基，根据氨基酸密码子的规律，密码子第3个碱基的变化不会影响它所编码的氨基酸，因此通过设计引物：
图4同义突变引入BamHI的位置
Fig. 4Introduction BamHI site in PtoCesA1
by synonymous mutationPA1BamHR 5′gct gga tcc tga gca ggc ttc ttc ttt gag3′，PA 1BamHF5′tca gga tcc agc tga ggt ata cag aga tgc3′将1722位的碱基A变为碱基G（下划线的G），这样通过同义突变在PtoCesA1基因的中部引入了酶切位点BamHI。同时在起始密码子和中止密码子处设计以下带酶切位点引物：PA 1SacIR 5′gcc gag ctc act ggg aga gac tta ttg gag3′ PA 1XbaIF 5′gca tct aga atg atg gaa tct ggg gct cct3′（下划线部分为酶切位点）以引入的BamHI酶切位点为分界点将全长基因分为 PtoCesA1BR和PtoCesA1BF两段。其中PtoCesA BF中带有SacI酶切位点。先利用SacI 和BamHI两个酶切位点将不带SacI酶切位点的PtoCesA1BR克隆到表达载体中，然后再利用BamHI和XbaI酶切位点将PtoCesA1BF克隆到表达载体中，构建好的表达载体命名为pBIPA1。总体的构建策略见图5。图5PtoCesA1基因植物表达载体的构建
Fig. 5Construction of pBIPA1 higher plant expression vector2.4PtoCesA1基因植物表达载体的鉴定
根据构建好的PtoCesA1基因正义表达载体酶切位点的分析，PtoCesA1基因正义表达载体经SacI单酶切后与用XbaI和BamHI 双酶切后，都应出现两条带谱，一条超过8.0kb，一条为1.7kb左右。我们将PtoCesA1基因正义表达载体质粒DNA酶切后电泳出现如下电泳谱（图6），符合预期结果。用基因的两端引物进行PCR检测也能扩增出3215bp的亮带(图7)。证明全长基因PtoCesA1基因确实构建到植物表达载体pBI121中。
图6植物表达载体pBIPA1的酶切电泳图_
1: 单酶切产物;_ 2: 双酶切产物; 3: 1kb marker