作者姓名:殷华平
专业名称:预防兽医学
指导教师:郭万柱
论文题目:传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达
作者简介:殷华平,男, 1977年8月出生,2001年考取四川农业大学动物科技学院预防兽医学硕士研究生,于2004年通过论文答辩获得硕士学位,同年考取四川农业大学博士研究生,主要从事动物传染病病原分子生物学,博士研究生期间曾参与伪狂犬病病病毒基因工程缺失疫苗的部分研制和新兽药证书的申报工作,作为主要研究人员参与国家自然科学基金项目 "猪细小病毒病毒样颗粒(VLPs)重组猪圆环病毒疫苗株的构建(项目编号:30500019),参与实验室部分专利的申请工作,先后在《畜牧兽医学报》,《浙江大学学报》(农业与生命科学版),《中国预防兽医学报》等期刊上发表论文10余篇.
摘 要
传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科,主要引起猪的肠炎和严重的腹泻,新生仔猪的感染将导致严重的的死亡,给养猪业造成了巨大的危害和经济损失.TGEV基因组为单股正链RNA,具有感染性,全长约28.5 kb,5′端20 kb序列编码病毒的复制酶多聚蛋白,3′端约8.3 kb编码4种结构蛋白(S,sM,M,N)和4种非结构蛋白,这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用.其中S蛋白具有重要的生物学功能:携带有主要的B淋巴细胞抗原决定簇,是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白;含有宿主细胞氨肽酶的受体识别位点,决定其宿主组织细胞亲嗜性;是决定TGEV的毒力的基因之一;具有细胞膜融合作用,协助病毒从细胞核蛋白进入细胞浆;具有血凝活性区.目前,TGEV部分基因的功能还不完全清楚,因此本文拟通过RT-PCR的方法扩增获得TGEV的全长cDNA片段,并分段克隆大片段cDNA,为后期进行感染性克隆,基因功能研究,致病机制和疫苗的开发打下坚实的基础,也为冠状病毒特别SARS等的研究提供参考.
参考GenBank登陆的TGEV序列,设计了6对引物,以抽提的TGEV细胞毒总RNA为模板,分段扩增获得了TGEV-31,TGEV-32,TGEV-33,TGEV-34,TGEV-35,TGEV-36共6段PCR产物,其大小分别为1.5kb,2.0kb,1.1kb,1.4kb,1.4kb,1.3kb,扩增片段与pGM-T载体连接获得了pGMT- 31,pGMT- 32,pGMT- 33,pGMT- 34,pGMT- 35,pGMT- 36共6个克隆,分别克隆了1456bp,1957bp,1079bp,1362bp,1427bp,1327bp 的TGEV cDNA片段,经生物信息学软件拼接共获得了TGEV 3' 8495bp的序列.基于TGEV S,M,sM,N,Nsp3a,Nsp3b,Nsp7的进化树分析表明,TGEV 与TS,HN2002,TO14,TS,PURDUE等毒株具有非常近的亲缘关系.
为了获得TGEV的全长cDNA , 参考NCBI登陆的TGEV病毒的序列,设计了7对引物, 以抽提的TGEV细胞毒的总RNA为模板,分段扩增获得了TGEV-A,TGEV-B,TGEV-C1(mu),TGEV-C2(mu),TGEV-DE,TGEV-F 6片段PCR产物,其大小分别为6.2kb,5.3kb,2.3kb,3.0kb,6.9kb,5.1kb.通过点突变的方法运用,以TGEV-C1(mu),TGEV-C2(mu)为模版,重叠PCR法扩增出了TGEV-C片段,其大小为5.3kb.TGEV-A,TGEV-B,TGEV-C,TGEV-DE,TGEV-F五个cDNA大片段,分别与pGM-T载体连接,结果仅成功克隆了其中的TGEV-A,TGEV-B,TGEV-F三个片段,分别命名为pTA-A,pTA-B,pGM-T.
为了在原核细胞和真核细胞中进行S基因主要抗原片段的表达,设计一对引物从TGEV细胞毒RNA中扩增出了包含S基因主要抗原的片段,分别连接pET32a(+),pET28a(+)和pEGFP-C1表达载体,获得重组质粒pET32a-S,pET28a-S,pEGFPC1-S,并在大场杆菌和Vero细胞中分别进行了原核和真核的表达,结果pET32a-S,pET28a-S在Ecoli BL细胞中未能获得良好表达,而pEGFPC1-S在Vero细胞中成功地获得了表达.
为了构建表达TGEV S基因主要抗原片段的PRV重组病毒,PCR扩增了S基因主要抗原片段,并克隆到已经构建成功的绿色荧光蛋白转移载体pPPI2.EGFP中,命名为pPPI2.EGFP.S,采用磷酸钙法将pPPI2.EGFP.S与SA215病毒基因组DNA共转染Vero细胞,结果在12小时以后可以观察到绿色荧光,24～48小时荧光到达最大量,48小时后荧光开始衰退,细胞在转染48小时后开始出现病变,96小时后细胞75%出现病变;在96小时后可以看见出现发生重组的绿色荧光病变细胞,挑取病灶反复纯化几次,获得了表达S基因主要抗原片断重组病毒PRV SA215-S,抽提病毒基因组DNA,PCR扩增能够从中扩增出大小为1.7kb 的S基因主要抗原片段.

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