中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2013, 35(4): 543–548 http://www.cjcb.org 收稿日期: 2012-11-03 接受日期: 2013-01-05 国家自然科学基金(批准号: 30972411)资助的课题 *通讯作者.Tel: 010-62336062, E-mail: chbly@sohu.com Received: November 3, 2012 Accepted: January 5, 2013 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.30972411) *Corresponding author. Tel: +86-10-62336062, E-mail: chbly@sohu.com 网络出版时间: 2013-04-01 14:47 URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/31.2035.Q.20130401.1447.001.html 超低温保存中的氧化应激和细胞凋亡 徐瑾刘芊李秉玲 刘燕* (北京林业大学园林学院, 国家花卉工程技术研究中心, 北京 100083) 摘要 作为一门广泛应用于医学、水产养殖和濒危物种保护等领域的生物技术, 超低温保存 已成为近年来低温生物学的研究热点之一.但到目前为止, 与超低温保存相关的机理并未得到全 面的阐释, 从而使超低温保存技术在应用上受到多方面的限制.该文对近二十年来超低温保存中 与氧化应激和细胞凋亡两大生理现象相关的研究作出综述, 以期为推进超低温保存技术的进步提 供理论依据. 关键词 超低温保存; 氧化应激; 细胞凋亡; 细胞膜 Oxidative Stress and Apoptosis with Cryopreservation Xu Jin, Liu Qian, Li Bingling, Liu Yan* (College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, National Floriculture Engineering Research Center, Beijing 100083, China) Abstract Cryopreservation, as a widely used biotechnology in fields such as medicine, aquaculture and endangered species protection in recent years, has become one of the research focuses in cryobiology. However, many of the molecular and biochemical mechanisms involved in this process are poorly understood, which restricts the application of cryopreservation in more biological materials. This paper reviewed the researches about oxidative stress and apoptosis with cryopreservation in the last two decades to provide a theoretical basis for promoting advances in cryopreservation. Key words cryopreservation; oxidative stress; cell apoptosis; cell membrane 超低温保存(cryopreservation)是指将生物材料 活体采取一定的技术存入–80 °C以下的低温(通常为 液氮–196 °C)中保存, 需要时采取一定的方法使之回 到常温并正常生长的一整套生物技术. 由于在医学、 农业、畜牧业及食品等相关领域有着广泛的应用前 景, 超低温保存已成为近年来低温生物学的研究热 点之一[1] .近年来, 超低温保存的技术研究已趋于成 熟, 除了基于低温脱水的传统的超低温保存技术外, 新兴的基于细胞内部溶质玻璃化的超低温保存技术 的发展, 极大地扩充了超低温保存的应用范围[2] .超 低温保存技术的发展依赖于其机制的解答, 而机制 的解答也会起到指导超低温保存技术发展的作用. 但是, 就目前的现状而言, 超低温保存的机制研究相 对滞后, 这也在一定程度上限制了超低温保存技术 应用范围的进一步扩大. 近年来的研究发现, 在超低温保存中往往伴随 着氧化应激和细胞凋亡两大生理现象, 这些现象是 否与超低温保存密切相关, 是否会影响超低温保存 的效果, 是否可以作为改进超低温保存技术的依据, 这些问题也逐渐得到了研究者的关注.本文对近 二十年来超低温保存中与氧化应激和细胞凋亡两大 生理现象相关的研究作出综述, 以期为推进超低温 保存技术的进步提供理论依据. 544 · 综述 · 1 超低温保存中的氧化应激现象 氧化应激是指由于活性氧(reactive oxygen spe- cies, ROS)过度产生和抗氧化防御机制减弱, 导致活 性氧的生成和清除之间的平衡失调, 过量的活性氧 引起分子、细胞和机体的损伤[3-7] .诸多的研究发 现, 超低温保存往往伴随着生物材料中活性氧水平 的升高, 而过多的活性氧引起的氧化应激是导致生 物材料超低温保存损伤的重要原因之一.理论表明, 当活性氧的生成量大于细胞的抗氧化防御系统水平 时, 过多的活性氧就会攻击脂质、蛋白质或核酸等 大分子, 通过去除电子的方式, 促使其结构的修改和 功能的改变, 从而导致脂质的过氧化、蛋白质的变 性以及DNA或RNA的损伤[8-10] . Baumber[11] 对马精子的超低温保存研究发现, 高水平活性氧的生成会增加DNA的片段化和减少 谷胱甘肽的生成量, 并认为活性氧可能与精子获能 的信号通路相关.这与Meseguer等[12] 的发现存在一 定的一致性—谷胱甘肽过氧化物酶1和4的表达水 平及活性、谷胱甘肽浓度与人类精子超低温保存后 的恢复速率相关.Li等[13] 同样在人类精子的超低温 保存中发现, 保存后活性氧的生成量显著上升, 并且 与冻融后精子的生存力和运动性下降等变化呈现出 相关性, 因此认为超低温保存后精子质量的下降可 能是由氧化应激所造成的.Zribi等[14] 在人类精子的 超低温保存中也发现了保存后精子的DNA片段化 和氧化率显著增加的现象, 但并未对其产生机制做 出解释.Thomson等[15] 以8-羟化脱氧鸟苷(8-OHdG) 作为生物标记, 证明了超低温保存引起的人类精子 DNA片段化与氧化应激相关. 生物材料中活性氧的种类包括激活的单电子 氧(1 O2)、超氧阴离子自由基(·O2 – )、过氧化氢(H2O2) 和羟基自由基( · OH)等[16] .目前的研究显示, 与超 低温保存相关的氧化应激可能是由羟基自由基所主 导的.Fang等[16] 在研究中发现, 超低温保存后伴随 着可可体细胞胚的恢复, 羟基自由基产生的挥发性 碳氢化合物—甲烷, 呈现出一定的周期性变化规 律.更确凿的证据来自于Góes等[10] 的研究, 他们将 超低温保存后的山羊精子培养在4种不同的活性氧 诱导机制下(分别产生激活的单电子氧、超氧阴离 子自由基、过氧化氢和羟基自由基), 精子对羟基自 由基显示出了高敏感性. 为了减少或消除氧化应激的影响, 抗氧化剂在 超低温保存中得到了广泛的应用.抗氧化剂可以转 换活性氧, 防止其过剩, 从而最大限度地提高超低温 保存后细胞的存活率[17] .在众多的抗氧化剂中, 过 氧化氢酶经常作为冷冻和熔融过程中的添加剂使 用.研究表明, 添加过氧化氢酶可以显著减少超低 温保存后人类精子[13] 和马精子[11] 的活性氧的生成 量, 提高家猫精子的运动性和前向性[8] , 并改善人类 造血干细胞的黏附性和与迁移有关的属性等[18] .此外, 过氧化物歧化酶[8] 、依达拉奉[19] 、维他命E、维 他命C、谷胱甘肽、硫辛酸、甜菜碱[9] 、抗坏血酸[13] 、 蛋氨酸、肌醇、肉碱[20] 等物质也被作为抗氧化剂应 用于超低温保存中.最新的研究还显示, 精浆对于 解冻后马精子[11] 和山羊精子[10] 的恢复更为有效, 而 血小板裂解物对超低温保存后人类肝脏细胞代谢功 能的恢复更为有效[21] .这可能同样是与精浆和血小 板裂解物中含有抗氧化性的物质相关. 此外, 针对细胞膜的研究显示, 超低温保存会 造成细胞膜的大范围破坏, 因此往往将细胞膜的完 整性作为成功的超低温保存的最低标准[22] .如前所 述, 氧化应激是造成超低温保存中生物材料损伤的 重要原因之一.活性氧很容易氧化膜脂上的不饱和 脂肪酸.脂质的过氧化一方面改变了细胞膜的结构 和功能, 例如通透性的升高, 另一方面它会导致二次 脂质过氧化产物如醛的生成, 而醛分解后的丙二醛 (MDA)又会与蛋白质、酶类和DNA链接, 进一步导 致潜在的诱变[9,16-17] . Martinez-Montero等[23] 在甘蔗胚性愈伤组织超 低温保存后的第2天观察到了电导率的升高.尚晓 倩[24] 在芍药花粉的超低温保存中观察到电导率随保 存时间延长持续上升; 而李广清[25] 在山茶花粉的超 低温保存中发现花粉电导率是前期升高, 后期出现 下降趋势, 但仍高于对照.这些研究都说明超低温 保存确实在一定程度上对细胞膜造成了损伤, 从而 导致了细胞外电解质渗透液的增加.除了使用电 导率作为细胞膜通透性的参数外, 脂质过氧化的产 物丙二醛(MDA)也被用来作为检验超低温保存效果 的指标.超低温保存后, 山茶花粉[25] 、蜡梅花粉[26] 、 木薯茎尖[27] 、罗氏沼虾胚胎[28] 、留兰香茎尖[29] 等的 MDA含量均显著升高.超低温保存中氧化应激及 外源抗氧化剂关系的研究进展见图1. 除了以上脂质过氧化的间接证据外, 研究者还 证明了超低温保存对细胞膜脂类成分变化的直接 徐 瑾等: 超低温保存中的氧化应激和细胞凋亡 545 影响.Blesbois等[30] 发现超低温保存导致火鸡和珍 珠鸡精子的细胞膜胆固醇/磷脂的比例显著下降, 并 认为这种变化降低了细胞膜的流动性.Chakrabarty 等[31] 在山羊精子的超低温保存中发现, 总脂及其组 成成分的中性脂肪、糖脂和磷脂在超低温保存后 下降明显, 其中与磷脂相关的不饱和脂肪酸比例变 小, 而饱和脂肪酸比例上升, 因而认为山羊精子应对 超低温损伤的主要机制是通过优先脱落细胞膜中 亲水性的脂质成分而增加细胞膜的疏水性进行的. Odintsova等[32] 对海洋无脊椎动物幼虫细胞的研究显 示, 超低温保存极大地影响了细胞膜脂肪酸的饱和 度、单烯度和多烯度, 并且这种变化因保存的细胞 来源和使用的冷冻保护剂而存在差异. 鉴于以上研究, 相应的细胞膜保护措施也被应 用于超低温保存中, 其中通过一定的方式来增加胆 固醇和不饱和脂肪酸的含量是采取的主要方式.已 证明, 外援胆固醇的添加可以显著改善牛精子[33] 和 马精子[34] 超低温保存后的存活率, 而Ω-3脂肪酸可以 显著提高超低温保存后不饱和脂肪酸的含量[35] .此外, 还有研究发现, 蔗糖的预培养可以使香蕉悬浮 细胞超低温保存后豆甾醇/甾醇的比例, 总脂肪酸 中的中性脂质、糖脂和鞘脂的成分以及游离脂肪 酸酸含量显著增高, 并使中性脂肪的双键指数增加 以及糖脂和鞘脂、磷脂和游离脂肪酸的双键的减 少, 并提高了超低温保存后的存活率[36] .而利用毛 猴素进行化学去脂, 可以显著提高猫胚胎超低温保 存后的存活率、桑椹胚和胚泡的形成率[37] .这些 保护措施可能都与改变细胞膜脂类成分的含量相 关. 2 超低温保存中的细胞凋亡现象 超低温保存造成的细胞死亡主要有以下三种 类型: 细胞破裂(与冰晶生成有关)、细胞坏死和细 胞凋亡[38] .部分研究发现, 超低温保存造成的细胞 死亡具有迟发性, 进一步研究迟发性死亡的背后机 制显示, 这种死亡主要是由细胞坏死和细胞凋亡这 两种途径所造成的[39] .其中, 区别于细胞坏死的被 动过程, 细胞凋亡作为一种与能量相关的, 由基因控 Normal growth and development Metabolism ROS .OH from cryopreservation process The balance of oxidant-antioxidants in the system The imbalance of oxidant-antioxidants in the system Excess ROS Antioxidant system Antioxidants Decrease of ROS The addition of antioxidants (eg. catalase, vitamin E, glutathione) Oxidative stress Lipid peroxidation of membrane DNA or RNA damage (eg. DNA fragmentation) Denaturation of proteins, changes in protease enzyme activity 图1 超低温保存中氧化应激及外源抗氧化剂作用 Fig.1 Effect of antioxidants to the pro-oxidant/antioxidant balance in the cryopreservation 546 · 综述 · 制的细胞自主、有序的死亡方式, 得到了超低温保 存机制研究者的广泛关注. 细胞凋亡通常会采用半胱氨酸蛋白酶活力、 磷脂酰丝氨酸的外化、线粒体膜电位的改变和 DNA片段化等参数进行检测[40] .Paasch等[41] 比较 了超低温保存对人类精子细胞凋亡参数的影响, 发 现超低温保存后, 半胱氨酸蛋白酶-3、-8和-9的活 性显著上升, 线粒体膜电位下降, 但DNA片段不存 在显著变化.Martin等[42-43] 同样在超低温保存后的 牛精子中发现线粒体膜电位的降低、半胱氨酸蛋 白酶活性和细胞膜通透性升高等现象, 并检测到了 细胞色素C和凋亡诱导因子这两种伴随细胞凋亡的 蛋白的产生, 但没有发现DNA片段化和细胞核浓 缩的显著变化.Vogel[44] 通过免疫印迹技术比较了 人类真皮的成纤维细胞中线粒体蛋白质Bcl-XL和Bax的比值(这两种蛋白的比值代表了细胞凋亡正 向和负向的比例), 发现在超低温保存复温后比值 略有升高, 在之后的6 h和12 h显著上升, 直到24 h 才恢复到与对照相当的水平.Liu等[45] 在比较超低 温保存前后的小鼠卵巢卵泡的基因组时, 发现超低 温保存诱导了凋亡基因Fas和Fas配体的表达.Park 等[46] 同样证明了冻融过程引起了牛囊胚细胞中与 凋亡相关的生存素、Fas、热休克蛋白70和半胱氨 酸蛋白酶-3基因表达量的增加. 以上研究在证明超低温保存与细胞凋亡的相 关性之外, 也为如何减轻或消除细胞凋亡的影响指 明了道路.半胱氨酸蛋白酶抑制剂已被证明在猪 肝细胞超低温保存中降低了半胱氨酸蛋白酶-3的活 性、减少线粒体中细胞色素C的释放, 减慢线粒体膜 电位的下降速度, 并使肝细胞活力的功能指标— 白蛋白产量、 地西泮的代谢和尿素产量显著增加[47] . 而在大鼠的肝细胞超低温保存中, 添加半胱氨酸蛋 白酶抑制剂则显著改善了复温后6 h和24 h的肝细胞 的分化能力和功能[48] . 氧化应激和细胞凋亡作为近年来超低温保存 中生理现象的两大研究热点, 其本身也存在着千丝 万缕的联系.研究表明, 超低温保存中出现的氧化 应激不仅可以直接造成细胞损伤, 也可能诱导了细 胞凋亡, 如活性氧活化核转录因子NF-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB), 导致细胞凋亡; 或通过作用 于线粒体介导细胞凋亡; 活性氧导致DNA损伤, 激活p53, 诱导细胞凋亡以及ROS激活SAPK通路介导 细胞凋亡等[49] . 图2所示线粒体产生的活性氧介导的细胞凋亡, 可以在一定程度上反映超低温保存中细胞凋亡与氧 化应激的关系. 图2 由线粒体产生的活性氧介导的细胞凋亡示意图(根据参考文献[50]修改) Fig.2 Schematic representation of apoptosis which is mediated by ROS generated by mitochondria(modi?ed from reference [50]) Mitochondria Death receptor p53 e– p21 ROS Antioxidants NF-κB AP-1 Cell cycle arrest Loss of ?ψ Megapores formation Release of cytochrome C(Cyt C) Apaf-1+ATP+Cyt C "apoptosome" Caspase-9 Caspase cascade Caspase-activated DNase(CAD) Digestion of proteins Digestion of DNA Apoptosis 徐 瑾等: 超低温保存中的氧化应激和细胞凋亡 547 3 结语和展望 超低温保存中有关氧化应激和细胞凋亡两大 生理现象的研究还处于起步阶段, 本质的揭示尚需 要大量的实验支持.对超低温保存中氧化应激和细 胞凋亡这两大生理现象广泛和深入的研究, 不仅对 揭示超低温保存机制有重要的理论意义, 也将为超 低温保存技术的发展提供一条新的思路. 围绕该研究方向, 未来的超低温保存研究将集 中在超低温保存技术中探索更多的抗氧化剂(包括 酶类和非酶类)的使用效果, 从而开发新型的保护剂; 超低温保存的技术策略也会更多地通过防止细胞膜 氧化, 而不是仅仅关注冰晶对细胞膜的伤害展开; 超 低温引起细胞凋亡的信号途径及其阻断技术也会得 到深入的研究, 从而提高超低温保存材料的成活率. 参考文献 (References) 1 李秉玲. 芍药属植物超低温保存花粉的差异表达蛋白质研究 及花粉库的建立(博士论文). 北京林业大学(Li Bingling. 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Tel: +86-10-62336062, E-mail: chbly@sohu.com 网络出版时间: 2013-04-01 14:47 URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/31.2035.Q.20130401.1447.001.html 超低温保存中的氧化应激和细胞凋亡 徐瑾刘芊李秉玲 刘燕* (北京林业大学园林学院, 国家花卉工程技术研究中心, 北京 100083) 摘要 作为一门广泛应用于医学、水产养殖和濒危物种保护等领域的生物技术, 超低温保存 已成为近年来低温生物学的研究热点之一.但到目前为止, 与超低温保存相关的机理并未得到全 面的阐释, 从而使超低温保存技术在应用上受到多方面的限制.该文对近二十年来超低温保存中 与氧化应激和细胞凋亡两大生理现象相关的研究作出综述, 以期为推进超低温保存技术的进步提 供理论依据. 关键词 超低温保存; 氧化应激; 细胞凋亡; 细胞膜 Oxidative Stress and Apoptosis with Cryopreservation Xu Jin, Liu Qian, Li Bingling, Liu Yan* (College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, National Floriculture Engineering Research Center, Beijing 100083, China) Abstract Cryopreservation, as a widely used biotechnology in fields such as medicine, aquaculture and endangered species protection in recent years, has become one of the research focuses in cryobiology. However, many of the molecular and biochemical mechanisms involved in this process are poorly understood, which restricts the application of cryopreservation in more biological materials. This paper reviewed the researches about oxidative stress and apoptosis with cryopreservation in the last two decades to provide a theoretical basis for promoting advances in cryopreservation. Key words cryopreservation; oxidative stress; cell apoptosis; cell membrane 超低温保存(cryopreservation)是指将生物材料 活体采取一定的技术存入–80 °C以下的低温(通常为 液氮–196 °C)中保存, 需要时采取一定的方法使之回 到常温并正常生长的一整套生物技术. 由于在医学、 农业、畜牧业及食品等相关领域有着广泛的应用前 景, 超低温保存已成为近年来低温生物学的研究热 点之一[1] .近年来, 超低温保存的技术研究已趋于成 熟, 除了基于低温脱水的传统的超低温保存技术外, 新兴的基于细胞内部溶质玻璃化的超低温保存技术 的发展, 极大地扩充了超低温保存的应用范围[2] .超 低温保存技术的发展依赖于其机制的解答, 而机制 的解答也会起到指导超低温保存技术发展的作用. 但是, 就目前的现状而言, 超低温保存的机制研究相 对滞后, 这也在一定程度上限制了超低温保存技术 应用范围的进一步扩大. 近年来的研究发现, 在超低温保存中往往伴随 着氧化应激和细胞凋亡两大生理现象, 这些现象是 否与超低温保存密切相关, 是否会影响超低温保存 的效果, 是否可以作为改进超低温保存技术的依据, 这些问题也逐渐得到了研究者的关注.本文对近 二十年来超低温保存中与氧化应激和细胞凋亡两大 生理现象相关的研究作出综述, 以期为推进超低温 保存技术的进步提供理论依据. 544 · 综述 · 1 超低温保存中的氧化应激现象 氧化应激是指由于活性氧(reactive oxygen spe- cies, ROS)过度产生和抗氧化防御机制减弱, 导致活 性氧的生成和清除之间的平衡失调, 过量的活性氧 引起分子、细胞和机体的损伤[3-7] .诸多的研究发 现, 超低温保存往往伴随着生物材料中活性氧水平 的升高, 而过多的活性氧引起的氧化应激是导致生 物材料超低温保存损伤的重要原因之一.理论表明, 当活性氧的生成量大于细胞的抗氧化防御系统水平 时, 过多的活性氧就会攻击脂质、蛋白质或核酸等 大分子, 通过去除电子的方式, 促使其结构的修改和 功能的改变, 从而导致脂质的过氧化、蛋白质的变 性以及DNA或RNA的损伤[8-10] . Baumber[11] 对马精子的超低温保存研究发现, 高水平活性氧的生成会增加DNA的片段化和减少 谷胱甘肽的生成量, 并认为活性氧可能与精子获能 的信号通路相关.这与Meseguer等[12] 的发现存在一 定的一致性—谷胱甘肽过氧化物酶1和4的表达水 平及活性、谷胱甘肽浓度与人类精子超低温保存后 的恢复速率相关.Li等[13] 同样在人类精子的超低温 保存中发现, 保存后活性氧的生成量显著上升, 并且 与冻融后精子的生存力和运动性下降等变化呈现出 相关性, 因此认为超低温保存后精子质量的下降可 能是由氧化应激所造成的.Zribi等[14] 在人类精子的 超低温保存中也发现了保存后精子的DNA片段化 和氧化率显著增加的现象, 但并未对其产生机制做 出解释.Thomson等[15] 以8-羟化脱氧鸟苷(8-OHdG) 作为生物标记, 证明了超低温保存引起的人类精子 DNA片段化与氧化应激相关. 生物材料中活性氧的种类包括激活的单电子 氧(1 O2)、超氧阴离子自由基(·O2 – )、过氧化氢(H2O2) 和羟基自由基( · OH)等[16] .目前的研究显示, 与超 低温保存相关的氧化应激可能是由羟基自由基所主 导的.Fang等[16] 在研究中发现, 超低温保存后伴随 着可可体细胞胚的恢复, 羟基自由基产生的挥发性 碳氢化合物—甲烷, 呈现出一定的周期性变化规 律.更确凿的证据来自于Góes等[10] 的研究, 他们将 超低温保存后的山羊精子培养在4种不同的活性氧 诱导机制下(分别产生激活的单电子氧、超氧阴离 子自由基、过氧化氢和羟基自由基), 精子对羟基自 由基显示出了高敏感性. 为了减少或消除氧化应激的影响, 抗氧化剂在 超低温保存中得到了广泛的应用.抗氧化剂可以转 换活性氧, 防止其过剩, 从而最大限度地提高超低温 保存后细胞的存活率[17] .在众多的抗氧化剂中, 过 氧化氢酶经常作为冷冻和熔融过程中的添加剂使 用.研究表明, 添加过氧化氢酶可以显著减少超低 温保存后人类精子[13] 和马精子[11] 的活性氧的生成 量, 提高家猫精子的运动性和前向性[8] , 并改善人类 造血干细胞的黏附性和与迁移有关的属性等[18] .此外, 过氧化物歧化酶[8] 、依达拉奉[19] 、维他命E、维 他命C、谷胱甘肽、硫辛酸、甜菜碱[9] 、抗坏血酸[13] 、 蛋氨酸、肌醇、肉碱[20] 等物质也被作为抗氧化剂应 用于超低温保存中.最新的研究还显示, 精浆对于 解冻后马精子[11] 和山羊精子[10] 的恢复更为有效, 而 血小板裂解物对超低温保存后人类肝脏细胞代谢功 能的恢复更为有效[21] .这可能同样是与精浆和血小 板裂解物中含有抗氧化性的物质相关. 此外, 针对细胞膜的研究显示, 超低温保存会 造成细胞膜的大范围破坏, 因此往往将细胞膜的完 整性作为成功的超低温保存的最低标准[22] .如前所 述, 氧化应激是造成超低温保存中生物材料损伤的 重要原因之一.活性氧很容易氧化膜脂上的不饱和 脂肪酸.脂质的过氧化一方面改变了细胞膜的结构 和功能, 例如通透性的升高, 另一方面它会导致二次 脂质过氧化产物如醛的生成, 而醛分解后的丙二醛 (MDA)又会与蛋白质、酶类和DNA链接, 进一步导 致潜在的诱变[9,16-17] . Martinez-Montero等[23] 在甘蔗胚性愈伤组织超 低温保存后的第2天观察到了电导率的升高.尚晓 倩[24] 在芍药花粉的超低温保存中观察到电导率随保 存时间延长持续上升; 而李广清[25] 在山茶花粉的超 低温保存中发现花粉电导率是前期升高, 后期出现 下降趋势, 但仍高于对照.这些研究都说明超低温 保存确实在一定程度上对细胞膜造成了损伤, 从而 导致了细胞外电解质渗透液的增加.除了使用电 导率作为细胞膜通透性的参数外, 脂质过氧化的产 物丙二醛(MDA)也被用来作为检验超低温保存效果 的指标.超低温保存后, 山茶花粉[25] 、蜡梅花粉[26] 、 木薯茎尖[27] 、罗氏沼虾胚胎[28] 、留兰香茎尖[29] 等的 MDA含量均显著升高.超低温保存中氧化应激及 外源抗氧化剂关系的研究进展见图1. 除了以上脂质过氧化的间接证据外, 研究者还 证明了超低温保存对细胞膜脂类成分变化的直接 徐 瑾等: 超低温保存中的氧化应激和细胞凋亡 545 影响.Blesbois等[30] 发现超低温保存导致火鸡和珍 珠鸡精子的细胞膜胆固醇/磷脂的比例显著下降, 并 认为这种变化降低了细胞膜的流动性.Chakrabarty 等[31] 在山羊精子的超低温保存中发现, 总脂及其组 成成分的中性脂肪、糖脂和磷脂在超低温保存后 下降明显, 其中与磷脂相关的不饱和脂肪酸比例变 小, 而饱和脂肪酸比例上升, 因而认为山羊精子应对 超低温损伤的主要机制是通过优先脱落细胞膜中 亲水性的脂质成分而增加细胞膜的疏水性进行的. Odintsova等[32] 对海洋无脊椎动物幼虫细胞的研究显 示, 超低温保存极大地影响了细胞膜脂肪酸的饱和 度、单烯度和多烯度, 并且这种变化因保存的细胞 来源和使用的冷冻保护剂而存在差异. 鉴于以上研究, 相应的细胞膜保护措施也被应 用于超低温保存中, 其中通过一定的方式来增加胆 固醇和不饱和脂肪酸的含量是采取的主要方式.已 证明, 外援胆固醇的添加可以显著改善牛精子[33] 和 马精子[34] 超低温保存后的存活率, 而Ω-3脂肪酸可以 显著提高超低温保存后不饱和脂肪酸的含量[35] .此外, 还有研究发现, 蔗糖的预培养可以使香蕉悬浮 细胞超低温保存后豆甾醇/甾醇的比例, 总脂肪酸 中的中性脂质、糖脂和鞘脂的成分以及游离脂肪 酸酸含量显著增高, 并使中性脂肪的双键指数增加 以及糖脂和鞘脂、磷脂和游离脂肪酸的双键的减 少, 并提高了超低温保存后的存活率[36] .而利用毛 猴素进行化学去脂, 可以显著提高猫胚胎超低温保 存后的存活率、桑椹胚和胚泡的形成率[37] .这些 保护措施可能都与改变细胞膜脂类成分的含量相 关. 2 超低温保存中的细胞凋亡现象 超低温保存造成的细胞死亡主要有以下三种 类型: 细胞破裂(与冰晶生成有关)、细胞坏死和细 胞凋亡[38] .部分研究发现, 超低温保存造成的细胞 死亡具有迟发性, 进一步研究迟发性死亡的背后机 制显示, 这种死亡主要是由细胞坏死和细胞凋亡这 两种途径所造成的[39] .其中, 区别于细胞坏死的被 动过程, 细胞凋亡作为一种与能量相关的, 由基因控 Normal growth and development Metabolism ROS .OH from cryopreservation process The balance of oxidant-antioxidants in the system The imbalance of oxidant-antioxidants in the system Excess ROS Antioxidant system Antioxidants Decrease of ROS The addition of antioxidants (eg. catalase, vitamin E, glutathione) Oxidative stress Lipid peroxidation of membrane DNA or RNA damage (eg. DNA fragmentation) Denaturation of proteins, changes in protease enzyme activity 图1 超低温保存中氧化应激及外源抗氧化剂作用 Fig.1 Effect of antioxidants to the pro-oxidant/antioxidant balance in the cryopreservation 546 · 综述 · 制的细胞自主、有序的死亡方式, 得到了超低温保 存机制研究者的广泛关注. 细胞凋亡通常会采用半胱氨酸蛋白酶活力、 磷脂酰丝氨酸的外化、线粒体膜电位的改变和 DNA片段化等参数进行检测[40] .Paasch等[41] 比较 了超低温保存对人类精子细胞凋亡参数的影响, 发 现超低温保存后, 半胱氨酸蛋白酶-3、-8和-9的活 性显著上升, 线粒体膜电位下降, 但DNA片段不存 在显著变化.Martin等[42-43] 同样在超低温保存后的 牛精子中发现线粒体膜电位的降低、半胱氨酸蛋 白酶活性和细胞膜通透性升高等现象, 并检测到了 细胞色素C和凋亡诱导因子这两种伴随细胞凋亡的 蛋白的产生, 但没有发现DNA片段化和细胞核浓 缩的显著变化.Vogel[44] 通过免疫印迹技术比较了 人类真皮的成纤维细胞中线粒体蛋白质Bcl-XL和Bax的比值(这两种蛋白的比值代表了细胞凋亡正 向和负向的比例), 发现在超低温保存复温后比值 略有升高, 在之后的6 h和12 h显著上升, 直到24 h 才恢复到与对照相当的水平.Liu等[45] 在比较超低 温保存前后的小鼠卵巢卵泡的基因组时, 发现超低 温保存诱导了凋亡基因Fas和Fas配体的表达.Park 等[46] 同样证明了冻融过程引起了牛囊胚细胞中与 凋亡相关的生存素、Fas、热休克蛋白70和半胱氨 酸蛋白酶-3基因表达量的增加. 以上研究在证明超低温保存与细胞凋亡的相 关性之外, 也为如何减轻或消除细胞凋亡的影响指 明了道路.半胱氨酸蛋白酶抑制剂已被证明在猪 肝细胞超低温保存中降低了半胱氨酸蛋白酶-3的活 性、减少线粒体中细胞色素C的释放, 减慢线粒体膜 电位的下降速度, 并使肝细胞活力的功能指标— 白蛋白产量、 地西泮的代谢和尿素产量显著增加[47] . 而在大鼠的肝细胞超低温保存中, 添加半胱氨酸蛋 白酶抑制剂则显著改善了复温后6 h和24 h的肝细胞 的分化能力和功能[48] . 氧化应激和细胞凋亡作为近年来超低温保存 中生理现象的两大研究热点, 其本身也存在着千丝 万缕的联系.研究表明, 超低温保存中出现的氧化 应激不仅可以直接造成细胞损伤, 也可能诱导了细 胞凋亡, 如活性氧活化核转录因子NF-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB), 导致细胞凋亡; 或通过作用 于线粒体介导细胞凋亡; 活性氧导致DNA损伤, 激活p53, 诱导细胞凋亡以及ROS激活SAPK通路介导 细胞凋亡等[49] . 图2所示线粒体产生的活性氧介导的细胞凋亡, 可以在一定程度上反映超低温保存中细胞凋亡与氧 化应激的关系. 图2 由线粒体产生的活性氧介导的细胞凋亡示意图(根据参考文献[50]修改) Fig.2 Schematic representation of apoptosis which is mediated by ROS generated by mitochondria(modi?ed from reference [50]) Mitochondria Death receptor p53 e– p21 ROS Antioxidants NF-κB AP-1 Cell cycle arrest Loss of ?ψ Megapores formation Release of cytochrome C(Cyt C) Apaf-1+ATP+Cyt C "apoptosome" Caspase-9 Caspase cascade Caspase-activated DNase(CAD) Digestion of proteins Digestion of DNA Apoptosis 徐 瑾等: 超低温保存中的氧化应激和细胞凋亡 547 3 结语和展望 超低温保存中有关氧化应激和细胞凋亡两大 生理现象的研究还处于起步阶段, 本质的揭示尚需 要大量的实验支持.对超低温保存中氧化应激和细 胞凋亡这两大生理现象广泛和深入的研究, 不仅对 揭示超低温保存机制有重要的理论意义, 也将为超 低温保存技术的发展提供一条新的思路. 围绕该研究方向, 未来的超低温保存研究将集 中在超低温保存技术中探索更多的抗氧化剂(包括 酶类和非酶类)的使用效果, 从而开发新型的保护剂; 超低温保存的技术策略也会更多地通过防止细胞膜 氧化, 而不是仅仅关注冰晶对细胞膜的伤害展开; 超 低温引起细胞凋亡的信号途径及其阻断技术也会得 到深入的研究, 从而提高超低温保存材料的成活率. 参考文献 (References) 1 李秉玲. 芍药属植物超低温保存花粉的差异表达蛋白质研究 及花粉库的建立(博士论文). 北京林业大学(Li Bingling. 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