项目编号: 项目类别: 农业转基因生物安全评价 申报书转cp4 epsps基因抗农达? 甜菜H7-1作为 加工原料进口的安全证书 孟山都远东有限公司北京代表处 2009年2月20日 中华人民共和国农业部制 孟山都公司申请书_H7-1 1 农业转基因生物安全评价 申报书项目名称:转cp4 epsps基因抗农达? 甜菜H7-1作为加工原料进口的安全证 书 申请单位:孟山都远东有限公司北京代表处 申请人: 地址: 北京市朝阳区工体北路甲2号盈科中心写字楼B座901室 邮政编码:100027 电话: 传真: e - mail: 填报日期:2009年2月20日 孟山都公司申请书_H7-1 2 孟山都公司文件 ? 2009 孟山都公司 版权所有 侵权必纠 本申请书受著作权法保护.本申请书只限于由孟山都公司提交的农业转基因生物安全行政主 管部门使用,并且只能用于本申请书的申请目的.没有孟山都公司的事先书面同意,任何出于其 它目的使用本申请书将被严格禁止.孟山都公司提交本申请书给相关行政主管部门并不表示孟山 都公司批准任何个人或实体获得任何权利对本申请书中涉及的知识产权进行授权许可或使用. 孟山都公司申请书_H7-1 3 填写说明1. 在填写申报书之前,应认真阅读《农业转基因生物安全管理条例》、《农业 转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》等 有关法规,了解相关的要求、标准和技术规范. 2. 此申报书同样适用于试验研究和中间试验的报告,但名称分别改为"农业转基 因生物试验研究报告书"和"农业转基因生物中间试验报告书",有些不使用的 条款可以不用填写.例如:实验研究的报告书就不用填写试验方案. 3. 申报书内容应当包括以下部分:目录、申请表、项目内容摘要、工作目的和 意义、国内外相关研究的背景资料、农业转基因生物安全评价、试验方案、 相关附件资料、申报单位农业转基因生物安全小组审查意见、申报单位审查 意见、所在省(市、自治区)的农业行政主管部门的审查意见. 填写申请表时,申请实验研究、中间试验、环境释放和生产性试验按表2 填写;申请农业转基因生物安全证书按表3填写. 申报书中安全评价、试验方案和相关附件资料部分依照附件I、II、III要求 逐条填写. 4. 申报书应当用中文填写,一式十份,一律使用 A4 纸,正文用小四宋体打印, 标准字间距和单倍行距,并提供软盘或光盘.对于不符合要求的申报书,不 予受理. 5. 申请者可以注明那些资料属于机密并说明理由. 6. 对于已批准过的环境释放或生产性试验,在试验结束后,若同一转基因生物 在原批准地点以相同规模重复试验,在申报时"安全性评价"部分可以省略. 7. 受理时间:每年三次,截止日期分别为 3 月1日,7 月1日和 11 月1日. 8. 受理单位:农业部科技发展中心. 地址:北京朝阳区麦子店街18号楼.邮政编码:100026.收款单位:农业部科技 发展中心;开户行:农行北京朝阳支行营业部;账号:010404010003699. 孟山都公司申请书_H7-1 4 目录内容页码 安全评价技术报告目录(技术报告为商业保密资料(CBI)5 保密商业资料(CBI)声明 6 孟山都公司关于农业部批复信函的说明 7 一、农业转基因生物安全证书申请表 9 二、项目内容摘要 11 三、工作目的和意义 13 四、国内外研究的相关背景资料 14 五、转基因植物的安全性评价 17 1. 受体植物的安全性评价 17 2. 基因操作的安全性评价 23 3. 转基因植物的安全性评价 46 4. 转基因植物产品的安全性评价 99 参考文献 103 六、相关附件资料 109 七、本单位农业转基因生物安全小组审查意见 151 八、 本单位审查意见 152 九、所在省(市、自治区)的农业行政主管部门的审查意见.153 孟山都公司申请书_H7-1 5 安全评价技术报告目录(技术报告为商业保密资料(CBI)) 报告 编号 技术报告名称 报告1 抗农达甜菜H7-1的分子生物学特征(PLT6016-1MA) 报告2 1999年在欧洲田间试验中抗农达甜菜H7-1地上部叶片和根部组织中CP4 EPSPS蛋白组 织表达水平的评价(Monsanto Study Report, MSL-17007) 报告3 1998-1999年德国田间试验中抗农达甜菜H7-1及常规对照品系生长发育及表现型和发 育观察结果——实质等同性评估(KWS Study Report, KWS 6016-1) 报告4 利用AD4、TOXIN5和ALLPEPTIDES数据库进行CP4 EPSPS蛋白的生物信息学分析 (Monsanto Study Report, MSL-18752) 报告5 CP4 EPSPS蛋白的小鼠急性口服毒性试验(Monsanto Study Report, MSL-13077) 报告6 H7-1和大肠杆菌生产的CP4 EPSPS蛋白理化性质和功能等同性评价 报告7 抗农达转化体H7-1甜菜浆 90天大鼠喂养试验(Monsanto Study Report, MSL-18820) 报告8 转基因甜菜H7-1的90天大鼠喂养试验(中国疾病预防控制中心检测报告) 报告9 大肠杆菌纯化的CP4 EPSPS蛋白在模拟胃液中离体消化分析(Monsanto Study Report, MSL-17566) 报告10 1999年在欧洲田间试验中抗农达甜菜H7-1及非转基因对照品系地上部叶片和根部组织 营养成分分析(Monsanto Study Report, AGREN 27.10.99) 报告11 世界经合组织关于甜菜新品系营养成分考虑的一致性文件——食用饲用营养成分和抗 营养因子(OECD: http://www.olis.oecd.org/olis/2002doc.nsf/LinkTo/env-jm- mono(2002)4) 报告12 转基因抗农达甜菜H7-1食用安全性综合评价报告(中国疾病预防控制中心) 报告13 抗农达甜菜H7-1基因插入位点的旁侧序列确定(PLT6016-4MA) 报告14 抗农达甜菜H7-1的特异性定性PCR检测方法(PLT6016-2MA) 报告15 抗农达甜菜H7-1的特异性定量PCR检测方法 报告16 转基因甜菜H7-1干甜菜浆抗营养因子皂角苷含量检测报告(农业部转基因生物食用 安全监督检验测试中心(北京)) 报告17 转基因甜菜H7-1干甜菜浆全组分检测报告(农业部转基因生物食用安全监督检验测试 中心(北京)) 孟山都公司申请书_H7-1 6 保密商业资料(CBI)声明 本申请书包含了许多属于孟山都公司和KWS公司开发并拥有的商业保密资料 (CBI,Confidential Business Information).这些商业保密资料(CBI)是由孟山都 公司和KWS公司投入巨大的人力物力,经过长时间的研究获得,包括研究路线的制 定、各种表达调控元件的DNA序列、遗传操作策略和各种安全评价的数据等资料. 孟山都公司和KWS公司目前只向世界各国农业转基因生物行政主管部门提交这些 CBI资料用于安全评价和审批的目的,而从未公开发表或向公众提供.孟山都和 KWS公司在中国国内外面临着许多技术实力很强的竞争对对手,一旦竞争对手获得 这些资料,竞争对手将会以很少人力物力投入在很短的时间内看发出类似H7-1的相 应产品,这对孟山都和KWS公司来说是不公平的.因此,孟山都和KWS公司依据 《农业转基因生物安全评价管理办法》第三章第二十七条的有关规定以及本申请书 的填写说明,要求对本申请书的CBI资料进行保密. 孟山都公司申请书_H7-1 7 孟山都公司关于农业部批复信函的说明 问题1 - 未提供目的基因插入位点的旁侧序列及特异性定性检测方法 1) 目的基因插入位点的旁侧序列, 5'-和3-端旁侧序列见下图,并详见报告13. 5'-端侧翼序列: 上图为甜菜H7-1的DNA序列与质粒DNA序列比对结果,上一行为H7-1的DNA序列,下 一行为PV-BVGT08质粒序列.H7-1的DNA序列中加下划线并字体加粗的部分为5'端侧 翼序列,箭头所指位置为外源基因插入位点;PV-BVGT08质粒序列中加下划线并字体 加粗的部分为右边界(Right Border). 3'-端侧翼序列: 上图为甜菜H7-1的DNA序列与质粒DNA序列比对结果,上一行为H7-1的DNA序列,下 一行为PV-BVGT08质粒序列.H7-1的DNA序列中加下划线并字体加粗的部分为3'端侧 翼序列,箭头所指位置为外源基因插入位点;PV-BVGT08质粒序列中加下划线并字体 加粗的部分为左边界(Left Border). 2)特异性定性PCR检测方法:报告14和报告15分别为特异性定性和定量PCR检 测方法. 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 孟山都公司申请书_H7-1 8 问题2 - 未提供农业部认定检测机构出具的抗营养因子皂角苷的检测报 告 皂角苷是天然存在于大豆、豌豆、马铃薯、茶叶和糖用甜菜等众多粮食和饲料 作物里的三萜系苷(Oakenfull和Sidhu, 1989).世界经合组织关于甜菜新品种营养和 抗营养成分的一致性文件(OECD, 2002)并未将皂角苷视为抗营养因子,也没有将 其视为在评价甜菜品种的营养一致性时需要考虑的化学成分.甜菜榨糖副产品会由 于皂角苷的存在引起反刍动物拒食,因此文献中将皂角苷看作拒食素,但迄今没有 皂角苷对人类和动物不良影响的报道.孟山都公司和KWS公司在对抗农达甜菜H7-1 进行食用安全性评价时将皂角苷作为抗营养成分进行了分析. 甜菜中的皂角苷最初是以齐墩果酸(Oleanolic acid)配糖的形式在叶片和根组 织中被发现的,齐墩果酸(Oleanolic acid)是甜菜皂角苷最普遍的糖苷配基,因此 甜菜中皂角苷的含量测定是通过HPCL法分析齐墩果酸的含量进行的.甜菜根齐墩 果酸含量的文献值域为75-965mg/kg鲜重(Lüdecke et.al, 1958). 由农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)对H7-1 和对照干甜菜 浆中齐墩果酸的含量进行了检测,结果分别为148mg/kg干重和121mg/kg干重,折合 为鲜重不会超过上述文献值域,说明抗农达甜菜与其亲本对照抗营养因子含量不会 有营养学和生物学意义上的不利影响,检测报告见报告16. 该测试中心对H7-1和亲本对照干甜菜浆全组分营养成分分析(报告17)和中国 疾病预防控制中心进行的90天大鼠喂养结果(报告8)也表明:H7-1和亲本对照干甜 菜浆主要营养成分及其含量无营养学和生物学意义上的显著差异,抗农达甜菜H7-1 对大鼠生长状况、食物利用、生存率、体征等方面的影响与亲本对照无生物学意义 上的显著差异.综合对受体(栽培型甜菜3S0057)、供体生物(农杆菌CP4小种)、 基因操作(农杆菌介导转化)以及H7-1和对照成分分析、新表达蛋白毒性、致敏性 等多方面的资料进行分析,认为抗农达甜菜H7-1与非转基因甜菜不存在生物学和营 养学上的差异,现有的食用安全性资料未发现H7-1与对照在食用安全性上存在差 别.(报告12,食用安全综合评价报告) 孟山都公司申请书_H7-1 9 一、农业转基因生物安全证书申请表 项目名称 转cp4 epsps基因 抗农达? 甜菜 H7-1作为加工原料进口的安全证书 项目来源 孟山都公司 转基因生物概况类别动物 ? 植物 ? 微生物 ? (用√表示 ) 转基因生物名称 抗农达甜菜H7-1 受体生物 中文名甜菜 学名Beta vulgaris 分类学地位藜科、甜菜属 品种(品系) 名称 3S0057 安全 等级 I 目的基因1 名称cp4 epsps 供体生物 Agrobacterium sp. strain CP4 生物学功能 表达CP4 EPSPS蛋白使转基因植物耐受草甘膦类除草剂. 启动子 P-FMV 终止子 E9 3' 载体1 PV- BVGT08 供体生物 Escherichia coli 载体2 …… *标记基因1 名称 无 供体生物 启动子 终止子 *标记基因2 名称 供体生物 启动子 终止子 …… 名称 供体生物 启动子 终止子 *报告基因1 名称 无 供体生物 启动子 终止子 *报告基因2 名称 供体生物 启动子 终止子 …… 名称 供体生物 启动子 终止子 孟山都公司申请书_H7-1 10 调控序列1 名称 转移肽序列Ctp2 来源 拟南芥 功能 协助CP4 EPSPS蛋白向叶绿体转移 调控序列2 名称 来源 功能 …… 名称 来源 功能 转基因方法 农杆菌介导法 基因操 作类型 1 2 3 转基因生物安全等级 I 转基因生物产品安全等级 I 试验概况中间试验 转基因生物名称及编号 试验的时间、地点和规模 环境释放 转基因生物名称及编号 批准文号 批准时间、地点和规模 生产性试验 转基因生物名称及编号 批准文号 批准时间、地点和规模 申请单位概况单位名称 孟山都远东有限公司 北京代表处 地址 北京市朝阳区工体北路甲2 号盈科中心B座901室 邮编 100027 电话 传真 电子邮件 申请人姓名 电话 传真 电子邮件 联系人姓名 电话 传真 电子邮件 * 若删除,应该在表中标注. (注:进口转基因生物直接申请安全证书的,本表"试验概况"一栏不填写) 孟山都公司申请书_H7-1 11 二、项目内容摘要 美国孟山都公司和德国 KWS SAAT AG 公司 (以下分别称为孟山都和KWS) 共同提交此申请,目的是请求批准进口抗农达? 甜菜作为加工原料的安全证书,拟进 口的主要产品是糖,经过榨糖工艺得到的糖基本不含转基因成分.进口该类甜菜是 抗农达转化体H7-1(简称H7-1转化体),或是这一转化体经常规育种方法得到的后 代.转化体H7-1对草甘膦耐受性是由一个插入的cp4 epsps编码序列基因盒赋予的, 这个基因盒能使受体植物编码生成源自于农杆菌小种CP4的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷 酸合成酶(EPSPS)蛋白.草甘膦是农达农用除草剂的有效成分,经基因改良的植株 在喷施草甘膦时不受影响,这是因为植株表达的抗性EPSPS酶的持续为植物提供所需 要的芳香族氨基酸(OECD, 1999; Padgette et al., 1996) . 甜菜(Beta vulgaris ssp. Vulgaris),具有长期的农业生产和使用历史.转化体 H7-1的基因修饰的目的,是通过采用添加CP4 EPSPS蛋白,赋予受体植物草甘膦耐 受性,从而简化和改进甜菜种植的杂草管理.供体生物农杆菌 (Agrobacterium sp.) CP4小种是赋予草甘膦抗性的cp4 epsps基因编码序列的来源.对cp4 epsps基因编码序 列特性的了解已很充分,CP4 EPSPS蛋白产物与源自植物和微生物的EPSPS蛋白具有 等同性,而后二者是十分普遍并具有长期的安全使用史. 转化载体PV-BVGT08质粒,含有cp4 epsps编码和调控序列,利用农杆菌介导植 物转化系统,将其导入甜菜,产生H7-1转化体.利用对H7-1转化体的分子生物学分 析,对插入植物基因组的拷贝数进行了定性分析.Southern杂交分析结果证实,H7-1 转化体在基因组内有单一插入位点,含有单一拷贝基因表达盒.在甜菜基因组里, 没有检测出转化载体中与完整基因盒连接或不连接的任何其它的遗传元件.H7-1转 化体中也没检测到质粒骨架序列,因此, H7-1转化体中插入的DNA序列仅仅编码 CP4 EPSPS蛋白. 对草甘膦的抗性表现经过四个世代分离分析表明,草甘膦抗性性状符合孟德尔单 基因性状遗传规律,这同时也证实了cp4 epsps基因的稳定性.对从三代植株中提取的 DNA进行Southern 杂交分析,进一步证实了H7-1转化体中导入基因的稳定性.按鲜 重计算,在H7-1转化体的上部和根部组织里,CP4 EPSPS蛋白的平均含量分别为161 ?g/g 和181 ?g/g. H7-1表达的CP4 EPSPS蛋白,在结构上和其它粮食作物(如大豆和玉米)和微 生物食品来源(如面包酵母)的内源EPSPS是一样的.同时,H7-1表达的CP4 EPSPS 蛋白质的氨基酸序列与已经获得商业化批准(FDA和USDA)的抗农达? 作物(如40- 3-2大豆、NK 603玉米、1544棉花和GT73油菜等)中表达的CP4 EPSPS具有>99%的 结构相似性.另外,天然的CP4 EPSPS蛋白质广范分布在环境中,已有的研究也表 明抗农达作物(表达CP4 EPSPS)不会对环境中其它生物产生毒性,也不会对人体 或动物的健康产生不良的影响. ? 抗农达是孟山都技术有限公司的注册商标. 孟山都公司申请书_H7-1 12 有关表现型的数据和信息证明,所申请的H7-1转化体,不会比常规甜菜更容易 遭受害虫危害.原因有以下几方面: (1)病虫害抗性观察证实,H7-1转化体不会比常 规甜菜更易感病虫害;(2)农艺性状、田间表现和形态学数据证明,H7-1转化体同常 规甜菜相比,在形态学和农艺学上并没有明显的差异,这表明H7-1转化体和常规甜 菜,在竞争性和杂草性上没有差异;(3)组成成份与品质分析表明,H7-1转化体在组 成成分和皂角苷抗营养因子方面等同于其对照;(4)在H7-1转化体和常规甜菜之间观 察到的唯一差异,就是CP4 EPSPS蛋白所表现的草甘膦抗性.因此,cp4 epsps基因, 包括其调控序列和产生的CP4 EPSPS蛋白,都没有导致H7-1转化体病虫害的易感 性. 对H7-1转化体可能对环境产生的后果,研究结果表明:H7-1转化体不会对植物 的有益生物或非靶标生物及某些受威胁的或者濒临灭绝的物种产生不良影响.其根 据如下:(1)甜菜野生苗造成的农艺后果将是微乎其微的,因为通过采用当前的农艺 方法很容易控制这些植物;(2)同常规甜菜相比,没有证据表明生态学互作有所改 变;(3) EPSPS族的蛋白,特别是一些抗农达作物,如玉米、大豆、欧洲油菜、棉花 和甜菜产生的CP4 EPSPS蛋白,已经证明它们同存在于其它粮食作物和常见微生物 里的EPSPS蛋白相似. (4) 对含有EPSPS蛋白的其它抗农达作物(如大豆、玉米、棉 花和欧洲油菜)对环境的影响,目前还没有负面报道. 营养成分试验结果:采集转化体H7-1和非转基因对照品种顶尖(叶)和根 (brei)组织,共进行了55项统计学对比,发现其中七项对比在p<0.05水平上具有统 计学差异.在这七项发现具有统计学差异的对比里,5%或者约为三项(0.05 X 55)是 靠随机产生的假阳性.在全部七项实例里,转化体H7-1具有统计学差异的组分的值 域,显著地重叠或者完全落在了非转基因对照、商用参照品种的观察值域里,以及 商用甜菜品种现有公开的值域里.这些结果证明,转化体H7-1关键营养元素和其它 重要营养成分的水平,等同于非转基因对照和其它商用甜菜品种的顶尖(叶)和根 (brei)组织里的水平. 甜菜是一种二年生植物,生长的第一年长出粗壮的多汁根,第二年长出种子 茎.美国商品甜菜只种植一年,目的是收获根而不是像玉米和大豆那样收获种子. 收获的甜菜根也不用于出口,而是在本地加工成食用糖和饲用甜菜浆和糖蜜. 孟山都远东有限公司北京代表处于2006年3月份首次提交了cp4 epsps基因的抗除 草剂甜菜H7-1作为加工原料进口中国的安全证书,先后在国内由农业部委托的检测 机构进行了食用安全性检测(90天大鼠喂养、营养成分分析、抗营养因子检测), 并在2006年9月、2008年7月和本次的申请中先后按照农业部农业转基因生物安全管 理办公室的要求补充了相关资料信息,在本申请书中,我们提交了有关H7-1的安全 性评价材料(包括受体植物的安全性评价材料、基因操作的安全性评价材料、转基 因植物及其产品的安全性评价材料)、美国有关法规部门的批准文件、特异性定性 定量检测方法,以及按照农业部转基因安全管理办公室的要求,在中国境内进行的 食用安全性检测报告及综合评价报告,望予以审查批准. 孟山都公司申请书_H7-1 13 三、工作目的和意义 抗农达? 甜菜H7-1转化体,其经济合作与发展组织(OECD)专用识别码为KM- ???H71-4,该转化体通过遗传操作,使其能够表达对农用除草剂农达的耐性,从而 大大简化和改进了甜菜生产中的杂草管理方法.杂草的管理费钱费工,在某些情况 下,为了甜菜获得最佳的产量,必须进行非常复杂的运作.目前,没有任何获批准 的除草剂活性成分能像抗农达农用除草剂那样提供如此的广谱、灵活的杂草防治手 段.否则,除了劳动力增加以外,农民必须采用多次施用复合除草剂的办法,但是 成本和效果差异很大. 草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine) (化学文摘社(CAS) 注册号码1071-83-6)是 农达农用除草剂的的活性成分,具有非选择性、叶面施用、广谱、苗后除草的特点 (Baird et al., 1971; Malik et al., 1989),也是世界上应用最广的除草剂.这主要是因为 其具有优良的杂草防治能力,以及环境安全和使用安全的特点(Geisy et al., 2000; Williams et al., 2000).但是,作物植株对于草甘膦的敏感性使农民不能在作物生长期 间向常规作物的顶部施用这种除草剂.生物技术的应用使人们得以开发耐受这一除 草剂的作物(Barry et al., 1992; Padgette et al., 1996),与农达农用除草剂的结合使用, 这样农达除草剂可以用在不同作物如甜菜上,使杂草的防治简单方便. 草甘膦对于防治大多数一年生和多年生的禾本科植物和阔叶杂草十分有效.草 甘膦具有优良的环保特性,如迅速地同土壤结合(抗淋溶)和生物降解(减少残 留),以及对哺乳动物、鸟类和鱼类极低的毒性等(Malik et al., 1989; Geisy et al., 2000; Williams et al., 2000).草甘膦被美国环境保护署(EPA)定为E类(证明对人类 无致癌性)(57 FR 8739).利用H7-1转化体进行甜菜生产,使农民可以采用农达农用 除草剂,有效地防治杂草,与此同时,还能从其良好的环境和安全特性上受益.总之,抗农达?甜菜有以下几方面优点: ? 向农民提供一个新型的、广谱杂草防治方法; ? 提高了杂草防治的灵活性,可以按需除草; ? 减少了对苗前除草剂使用的依赖性; ? 减少了同某些现有苗前和苗后除草剂有关的作物轮作的局限性,提高了种 植上的灵活性; ? 作为在当季杂草抗性管理计划中一个备选的除草剂,向农民提供了一个新 颖的防治手段; ? 使农民可以使用一种具有良好环境特点的除草剂. 本申请书旨在申请转cp4 epsps基因"抗农达? "甜菜 H7-1 作为加工原料进口中国 的安全证书,并不涉及田间释放和商业化生产. 孟山都公司申请书_H7-1 14 四、国内外研究的相关背景资料 全球转基因作物应用情况 全球人口在迅速增长,据估计到2025年全球人口将由2000年的65亿增加到85 亿,同时粮食需求也将在现在的基础上增加50%.事实上,通过常规的品种改良和 栽培技术改进,特别是杀虫剂的使用,粮食生产在过去几十年已经显著提高.上世 纪60年代兴起的细胞遗传学和细胞生物学技术引发了"绿色革命",使粮食作物的 产量显著提高、抗病性和抗虫性明显增强.然而,这些技术的广泛采用也同时给环 境和人类健康带来一些新的问题,如农药和化肥的使用导致土壤侵蚀加剧.同时, 在这些技术使用20年后,对粮食增产的贡献也明显减少.为克服这些问题,来自于 政府、大学、研究机构及公司的科学家们正在寻求新的技术和方法.随着重组DNA 技术的发展,到上世纪80年代科学家们已经开发出一些新的现代育种技术和方法, 其中利用农杆菌介导转化和基因枪转化的转基因技术是最为成功的一项. 2006年,利用转基因技术开发的遗传改良(genetically modified,GM)作物在 全球的种植面积超过1亿公顷,比2005年增长13%,占全球可耕地面积的4%,种植 转基因作物的国家也从2004年的17个增加到22个.其中美国、阿根廷、巴西、加拿 大、印度和中国是主要转基因作物种植国家. 1996年世界第一个转基因作物的商业化被批准.从1996年至2006年,转基因作 物的商业化发展速度,平均每年递增20%,特别是在一些工业化国家.就转基因性 状而言,目前通过转基因技术导入并商业化开发的最重要性状当属抗除草剂,2006 年抗除草剂的转基因作物(主要包括大豆、玉米、棉花、油菜)种植面积为6990万 公顷,占全球转基因作物种植面积的68%;其次是抗虫性,抗虫转基因作物(主要 是玉米、棉花和其他作物)面积为1900万公顷,占19%.还有其他一些转基因性状 也已被商业化利用,如抗病毒,只是种植面积相对较少.对于转基因作物,抗除草 剂大豆,包括聚合基因,是最大的转基因作物,2006年的种植面积达到5860万公 顷,占全球转基因作物总面积的57%;转基因玉米占第二位,达到2520万公顷,占25%,转基因棉花1340万公顷,占13%,转基因油菜为480万公顷,占5%(James, 2006; Brookes and Barfoot, 2006). 在美国和加拿大这样的工业化国家市场,由于新基因的开发和应用转基因作物 还会继续下去,同时会有越来越多的发展中国家开始应用或扩大应用转基因作物. 在未来3-5年内,导入减少投入的性状(input traits),如耐除草剂和抗虫性,依然是 转基因作物发展的主要趋势.2-3个转基因性状的聚合以及抗病毒性也会变得越来越 重要.科学家们会特别关注不同来源的、调控农艺性状的基因,尤其是抗虫基因. 然而,对于转基因作物中长期发展,增加产出的性状(主要是改变营养成分)必然 要被关注.实际上已经有一些这样的转基因作物被开发出来了,如:维生素A水稻、 高铁水稻、高蛋白转基因作物、去除致敏源和抗营养因子作物、改变淀粉和脂肪酸 构成的作物、提高抗氧化物之含量的作物、耐环境胁迫的作物和雄性不育作物. 孟山都公司申请书_H7-1 15 转基因作物的安全评价 遗传改良生物(GMO)安全评价的概念最早是由一些科学家于1975年在有关重 组DNA研究的Asilomar会议上提出的.这些科学家担心重组DNA技术可能会导致重 组病毒的产生,而这种重组病毒一旦从实验室泄漏会对公众健康产生不良影响.这 些科学家经过14个月的工作一致同意并起草了一份通过物理和生物方法防止危险试 验结果和物品扩散的指南,该指南成为1976年由国家卫生研究所重组DNA咨询委员 会起草的美国现代生物技术研究指南的基础.随后,其他一些国家也都采用了美国 现代生物技术研究指南. 关于转基因植物环境安全性评价,Cordle等(1991)描述了一种逐步进行安全 评价的方法,具体如下: A) 首先应该确定非改良生物的安全关注程度,包括: 1) 非改良生物的有害性和病原菌状态; 2) 在多变环境中适应的能力; 3) 在群落中的与其他生物的生态关系、功能和重要性; 4) 遗传信息转移的能力; 5) 监测和控制的可能性. B) 其次应该考虑其遗传学操作对安全性的影响,包括: 1) 遗传改良的过程; 2) 基因的构建和表达; 3) 分子生物学知识和其他信息在什么程度上可以用来评估转基因生物的 安全性. C) 第三步要综合考虑上述步骤的评价.遗传改良生物的安全评价要在综合有 关遗传改良生物和非遗传改良生物的所有已知信息后才可作出. 确定转基因植物的基因转移到周围环境中的可能性是非常重要的.转基因植物 的基因有可能逃逸到下列生物体中:(1)改良基因转移到微生物或病原菌;(2) 改良基因通过细菌感染为载体转移到其他植物物种重;(3)转基因植物扩散到自然 生态环境中并繁殖;(4)改良基因水平转移到野生物种.但是,目前还没有证据表 明转基因已经转移到微生物中或水平转移到其他植物中. A) 关于转基因植物的食品安全检测,国际食品规范委员会(Codex Alimentarius Commission)采用一些基本原则来评价来源于转基因植物和转基因 微生物的遗传改良食品(GM food).这些原则前提是依据预先评价、个案评 价和评价转基因的直接效应(由插入基因引起)和间接效应(由插入一个新基 因的互作结果引起).Codex 的安全评价原则要求评价下述方面 (Codex,2003; Codex, 2005):A) 对健康的直接影响(毒性); B) 引起过敏反应的倾向(过敏性); C) 特定成分,不管是营养成分还是毒性成分; D) 插入基因的稳定性; E) 特定遗传改良的营养效应; F) 插入基因可能引起的不预测结果. 孟山都公司申请书_H7-1 16 国际食品规范委员会制定的风险评估原则被普遍认为对于当前国际市场上的遗 传改良生物的安全评价是足够的.目前,所有已经上市遗传改良生物产品都经过严 格风险评估,与其相应的非改良生物产品比,是同样安全的(WHO Report, June 23, 2005).实际上,越来越多的新的转基因方法正在被采用,如无选择标记转化,这 些方法可以显著减少由于目前采用的、转基因随机插入所引起的潜在风险.同时, 越来越多的更加安全的基因也正在被克隆出来. 转cp4 epsps基因作物研究 草甘膦通过抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的合成,从而阻 断植物体内所必需的芳香族氨基酸的生物合成,导致植物死亡.因此,以草甘磷作 为有效成分的植物除草剂既可用于一年生或多年生的单子叶杂草,也可用于阔叶类 杂草.然而草甘膦属于非选择性除草剂,在杀死杂草的同时还会杀死农作物. 毫无疑问,抗草甘膦作物的应用可以对农业生产活动带来重要影响.首先,抗 草甘膦作物的应用可以为农民带来一种广谱杂草防除措施;第二,草甘膦是一种环 境友好性的除草剂;第三,可以在作物生长期使用草甘膦类除草剂;第四,抗除草 剂作物+除草剂的杂草防除系统可以很好的适应少耕或免耕系统,从而保持土壤水 分、减少土壤侵蚀和节省燃料;第五,提供低耗高效的杂草防除技术. 科学家长期以来一直致力培育抗除草剂的作物品种,但采用传统的育种技术 (如传统的诱变和选择技术)都未取得成功.从上世纪80年代开始,人们开始借助 于重组DNA技术来开发抗草甘膦的作物,并获得了成功.主要采用的原理或机制有3 个方面:一是表达5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸转移酶(EPSPS);二是转入一个与 草甘膦亲合性低的EPSPS基因;三是导入一个降解草甘膦的基因. 传统上,解决抗农达? (有效成分为草甘膦)问题的努力,更多的是集中在导入 一个编码对草甘膦抑制不太敏感的EPSPS(耐草甘膦的EPSPS)的基因.科学家们成 功地在土壤农杆菌CP4亚种中筛选到自然存在的EPSPS酶(CP4 EPSPS酶),该酶对 草甘磷的耐受表现出理想的的动力学参数(kinetic parameters)(appK1 [glyphosate] = 2.7 mM)和紧密结合PEP(appKmPEP] = 12 ?M).appK1 [glyphosate] 表示某种酶 对草甘膦的耐受性,appK1值越高表明该酶对草甘膦的耐受性越强.而appKm[PEP]则 表示某种酶与PEP的结合能力,appKm[PEP]值越低,表明该酶与PEP结合能力越强, 催化能力就越强.根据动力学参数,最终筛选出CP4 EPSPS蛋白,并从土壤农杆菌 CP4亚种中克隆了相应的基因(cp4 epsps基因),该基因已被转化到大豆、玉米、棉花、油菜等作物中去,栽培利用十余年. ? Registered trademark of Monsanto Technology LLC. 孟山都公司申请书_H7-1 17 五、转基因植物的安全性评价 1 受体植物的安全性评价 1.1 受体植物的背景资料 1.1.1 学名,俗名和其他名称 抗草甘膦甜菜的 受体植物学名甜菜(Beta vulgaris L.)属于藜科( Chenopodiaceae)甜菜属(Beta). 1.1.2 分类学地位; 甜菜属于:绿色植物门(Chlorophyta)、维管束植物亚门(Tracheophyta)、被 子植物纲(Angiospermae)、双子叶植物亚纲(Dicotyledoneae)、藜目( Chenopodiales)、藜科(Chenopodiaceae)、甜菜亚科(Betoideae)、甜菜族( Beteae)、甜菜属(Bata). 1.1.3 试验用受体植物品种 (或品系)名称; 试验用受体品系为栽培型甜菜3S0057. 1.1.4 是野生种还是栽培种; 3S0057品系为栽培种. 1.1. 5 原产地及引进时间; 甜菜的原产地是欧洲,也有人认为甜菜原产于底格拉斯河和幼发拉底河流域. 大约1896年引入我国. 1.1.6 用途; 甜菜是世界上两大糖料(甜菜和甘蔗)作物之一,主要用于制糖业.甜菜加工 的副产品甜菜浆和糖蜜可作为饲料用于畜牧业. 1.1.7 在国内的应用情况; 甜菜是我国主要的糖料作物之一,常年播种面积在30万至40万公顷,主要在我 国东北、华北、西北地区种植.其中东北地区种植面积最大,约占全国甜菜总面积 的50%以上.而今年西北特别是在新疆,甜菜的种植有较大发展,产量已近全国总产 的三分之一. 甜菜生产与应用,在中国已逾百年.自1905年建立我国第一家甜菜糖厂,至1949年新中国成立前,为我国甜菜制糖工业的早期;1949年至今为我国甜菜制糖工 业的发展阶段.建国后,我国甜菜科研单位通过系选、杂交,相继育成一批二倍体 多粒型品种.在60年代,开展多倍体育种工作,1972年首批育成普通多倍体品种双 孟山都公司申请书_H7-1 18 丰303号、双丰304号用于生产.随着多倍体甜菜品种的推广应用,使之在生产上占 主导地位. 根据甜菜生物学特性,按照播种期可以分为春播区、夏播区和秋冬播区三大类 型.春播区包括东北区、华北区的北部和西北区.这些地区无霜期短、积温较少、 日照长、昼夜温差大,属一年一熟农业.夏播区主要是华北地区以及江苏、安徽省 北部的部分区域等,这些地区无霜期较长、夏季高温多雨.秋冬播区主要包括福建 省、湖南省、江苏省、广东省、广西省、江西省等. 1.1.8 对人类健康和生态环境是否发生过不利影响; 受体甜菜对人类健康和生态环境无不利影响. 1.1.9 从历史上看,受体植物演变成有害植物 (如杂草等) 的可能性; 受体甜菜演变成有害植物(如杂草等)的可能性非常小. 1.1.10 是否有长期安全应用的记录. 甜菜原产于欧洲,是重要的糖料作物,同时,榨糖后甜菜粕是重要的动物饲 料,有着长期的安全食用及种植历史. 甜菜在植物分类上属于藜科甜菜属,有栽培种和野生种.栽培种又有4个变种: 叶用甜菜、根用甜菜、饲用甜菜和糖用甜菜 (简称甜菜) .甜菜是二年生作物,第一 年主要进行营养生长,形成繁茂叶丛及肥大的主根(块根),同时块根中积累大量的蔗 糖.第二年主要进行生殖生长,经抽苔、开花、受精形成种子. 1、块根及根系:甜菜块根由根头、根颈、根体和尾根4部分构成.根头又称青 头或青顶,是缩短的茎,其上丛生叶子.根颈是根头最下排叶痕处至根沟顶端这部 分,根颈既不长叶,也不生根,它是由下胚轴发育而成.根颈以下至块根直径1厘米 以上部分为根体.根径1厘米以下部分为根尾.根体两侧各有一条根沟,根沟内生出 大量侧根.甜菜块根的形状因遗传及环境等因素的影响有较大差异.常见的有圆锥 形、楔形、纺锤形和锤形四种.一般圆锥形的多趋向高含糖,纺锤形的多趋向高 产.糖用甜菜的块根表皮颜色为白色或灰白色.而食用、饲用甜菜多呈红、橙、黄 等颜色.成熟块根的横切面上可以清楚地看到由维管束组成的圆环,一般为8—12 个.这种圆环数越多,维管束越密集,块根的含糖率也越高.甜菜块根不同部位的 糖分是不一样的.根头含糖最低,根体最高,根颈居中.非糖物质尤其是妨碍蔗糖 结晶的可溶性灰分和有害氮在根头中含量最高.因此种植甜菜应控制根头生长,切 削甜菜时也应尽量去掉根头.从横切面上看,块根中心部含糖最高,中层次之,外 层更低,块根的含糖率因品种、环境、耕作水平等因素有很大差异.一般来说块根 大小和含糖率之间存在相互制约关系,一般高产型品种含糖率偏低,而高糖型品种 则产量偏低.甜菜经济效益的主要指标是单位面积的产糖量.即:单位面积块根产 量*含糖率(%)=单位面积产糖量.甜菜是直根系作物,其根系由主根、侧根构成.甜 菜根系庞大,具有很强的吸水、抗旱耐盐碱的能力. 2、叶:甜菜出苗时,最先露出地面的两片叶子是子叶.子叶是甜菜植株最初的 同化器官.叶是甜菜主要的光合作用器官.它由叶片、叶柄组成.叶脉分布在叶片 孟山都公司申请书_H7-1 19 内并和块根中的维管束相连,把光合作用的产物运送到块根,又把植株生长所需的 营养物质和水分运送到叶片.一般来说多倍体品种或丰产型品种的叶片较大,叶色 浓绿,多皱褶;而二倍体品种或高糖型品种则叶片较小,叶色浅绿,叶片较平滑. 3、种株、花、种子:种株是指经过营养生长,第二年定植于田间的母根形成的 甜菜植株.甜菜是异花授粉作物,花是两性花,由5个萼片,5个雄蕊,1个雌蕊组 成.聚生花受精后形成的果实是聚花果,一般称做种球.1个种球含3—5粒种子,这 是多粒型种子;而单生花则形成单果,只含1粒种子,这就是单粒型种子.甜菜的种 球黄褐色,直径2—4毫米,千粒重15—25克.种球最外层是木质化的萼片,其下面 是由果盖、果壳组成的果皮.每个果壳中有1粒种子.种子外层是红褐色有光泽的种 皮,种子里肾脏形直径1.5--3㎜,厚1.5㎜左右.多粒种种子的重量一般不超过7毫克,单粒种较大,可达9毫克左右. 1.2 受体植物的生物学特征 1.2.1 是一年生还是多年生; 甜菜为两年生作物. 1.2.2 对人及其他生物是否有毒,如有毒,应说明毒性存在的部位及其毒性的性质; 甜菜无毒,对动物和人类健康是安全的.根据OECD关于甜菜新品系的评价考虑 文件(报告11),甜菜中不含抗营养因子. 1.2.3 是否有致敏原,如有,应说明致敏原存在的部位及其致敏的特性; 甜菜不含致敏原. 1.2.4 繁殖方式是有性繁殖还是无性繁殖,如为有性繁殖,是自花授粉还是异花授粉 或常异花授粉;是虫媒传粉还是风媒传粉; 甜菜的繁殖方式是有性繁殖,是异花授粉作物,主要靠风媒传粉. 1.2.5 在自然条件下与同种或近缘种的异交率; 在自然条件下甜菜同种之间异交率较高,与近缘种异交率低. 1.2.6 育性(可育还是不育,育性高低,如果不育,应说明属何种不育类型); 可育,存在雄性不育类型. 1.2.7 全生育期; 春播甜菜的全生育期为340-370天,夏播为220天左右. 1.2.8 在自然界中生存繁殖的能力,包括越冬性、越夏性及抗逆性等. 甜菜在其主要产区自然环境中无法越冬,必须窖储;在我国江苏、山东等地可 以露地越冬,第二年开花结实.甜菜具有耐旱、耐寒、耐盐碱的特点. 1.3 受体植物的生态环境: 1.3.1 在国内的地理分布和自然生境; 孟山都公司申请书_H7-1 20 甜菜在我国主要分布于北纬40度以上的东北、华北和西北三大地区.东北产区 包括松辽平原、三江平原.即黑龙江省、吉林省、辽宁省以及内蒙古自治区东部. 该产区属温带大陆性气候,冬季长、干燥寒冷,春秋季节短促,夏季高温多湿,年 平均温度5.4度.华北地区包括内蒙古西部、山西北部和河北北部,气候特点是冬季 干燥、夏季炎热、昼夜温差大.西北甜菜区主要包括新疆、甘肃的河西走廊、宁夏 的黄灌区,该区地处高原,属温带大陆性气候,为干旱半干旱地区或荒漠地区,冬 季干燥寒冷,春季短促,夏季炎热. 1.3.2 生长发育所要求的生态环境条件,包括自然条件和栽培条件的改变对其地理分 布区域和范围影响的可能性; 甜菜具有耐低温、抗逆性强、适应性广的特点,在我国分布较广,从北纬20度 至北纬50度之间均能种植. 1.3.3 是否为生态环境中的组成部分; 是甜菜种植区农业生态环境的组成部分. 1.3.4 与生态系统中其他植物的生态关系,包括生态环境的改变对这种(些)关系的 影响以及是否会因此而产生或增加对人类健康和生态环境的不利影响; 甜菜是我国的主要经济作物之一,没有由于种植甜菜对生态环境或人类健康构 成不利影响. 1.3.5 与生态系统中其他生物(动物和微生物)的生态关系,包括生态环境的改变对 这种(些)关系的影响以及是否会因此而产生或增加对人类健康或生态环境的不利 影响. 目前甜菜已成为我国重要的糖料作物,也是农业耕作实践中一个重要的轮作作 物,不会对人类健康或生态环境造成不利影响. 1.3.6 对生态环境的影响及其潜在危险程度; 甜菜不会对生态环境构成影响. 1.3.7 涉及到国内非通常种植的植物物种时,应描述该植物的自然生境和有关其天然 捕食者、寄生物、竞争物和共生物的资料. 不涉及. 1.4 受体植物的遗传变异: 1.4.1 遗传稳定性; 甜菜在自然条件下发生遗传变异的几率低,遗传稳定性好. 1.4.2 是否有发生遗传变异而对人类健康或生态环境产生不利影响的资料; 甜菜没有发生遗传变异而对人类健康或生态环境产生不利影响的资料. 1.4.3 在自然条件下与其他植物种属进行遗传物质交换的可能性; 与糖用甜菜近缘植物的异交 孟山都公司申请书_H7-1 21 糖甜菜主要通过风媒传粉和有限的虫媒传粉.在授粉期间,甜菜被认为是强烈 的自花不亲和性植物,这是由于其柱头在花开时尚未完全成熟(OECD, 2001),于是 需要同其它甜菜或者甜菜属的其它物种的植株进行异花授粉才能产生种子.如前面 讨论的那样,花药产生的花粉颗粒是圆形的,具有无数的凹陷,花药可以产生约 17000粒花粉颗.散布开来的花粉颗粒的生活力最多只有24个小时,这取决于温度和 湿度等环境条件 (OECD, 2001). 受花粉调节的、从一个植物物种向另一个物种的基因漂移(如糖甜菜向另一个物 种的基因流动)只有在下列的条件被满足之后才会发生:1) 两个物种有性兼容;2)两 个物种同时开花;以及3) 两个物种种植地区靠近.欧洲目前已经测定了从甜菜向野生 和杂草性甜菜属物种进行花粉调节的基因流动特点(Desplanque et al., 1998) .利用H7-1 进行花粉调节的基因飘移,由于存在地理和农艺性状上的屏障,不会产生出抗农达农 用除草剂的糖甜菜亲缘品种. 影响基因飘移的地理因素 众所周知,糖甜菜能同甜菜属的其它成员,包括野生亲缘种自由杂交(OECD, 2001).在美国,能和糖甜菜杂交的野生亲缘种不多,而能与之杂交的野生亲缘种之 中,B. vulgaris ssp. maratima 和B. macrocarpa 的群体生长在加利福尼亚州,有证据 表明B. macrocarpa 已经同甜菜栽培品种实现了杂交 (Bartsch和Ellstrand, 1999) .它们 是美国现在仅有的两种甜菜野生亲缘种,但它们只生长在加利福尼亚州.在旧金山 地区存在一个群体,但在该地区,没有甜菜种植.第二个群体,从植物分类学上 讲,属于Beta macrocarpa,是在帝王谷发现的,被认为是糖甜菜里的一种杂草.根据Panella 和Llewellyn博士的观点,在美国的耐受除草剂甜菜栽培种和B. macrocarpa 或者和其它野生甜菜物种之间的基因流动,导致杂交植物、造成杂草问题是极不可 能的.其根据是B. macrocarpa的花期比甜菜早得多,没有明显的重叠,所以在田间 它们在时间上是相互绝缘的.此外,对温室里产生的F1代杂交种进行的评价证明, 它们主要是雄性不育,而随后的F2代杂交植株具有严重遗传率和生长习性障碍,这 些特点都不会支持自然界里杂交植株的存活. 还有如下的证据支持Panella 和Llewellyn博士的结论,即:通过二年生长习性的 甜菜传播有活力的花粉,大面积繁育糖甜菜种子,主要是在俄勒冈的Willamette河谷,在那里没有已知的野生甜菜物种.在俄勒冈,每年约有3000至5000英亩用来生 产种子.鉴于甜菜栽培品种的野生亲缘种只存在于加利福尼亚州,所以,在野生亲 缘种和糖甜菜栽培品种间,预期不会发生基因漂移. 减少基因飘移可能性的农艺因素 除了地理因素能影响基因流动之外,农艺因素也能影响甜菜的基因漂移的可能 性.在俄勒冈进行的甜菜种子的繁育过程中,按照能否遵守俄勒冈种子认证标准, 选定了签合同的种植者.这些标准要求在糖甜菜品种之间要最少有3200英尺(约1000米)宽的隔离带,而同其它甜菜属物种,包括饲料甜菜、红甜菜和叶用甜菜, 应至少有8000英尺(约2400米)宽的隔离带.这样的隔离宽度必定会阻止花粉的 (风/昆虫)传播,据报道,花粉的传播距离小于1000米(Dark, 1971). 孟山都公司申请书_H7-1 22 由于糖甜菜种植的目的是收获营养块根,所以,从遗传学角度来说,糖甜菜生 产中发生的花粉调节的基因漂移,其发生的可能性是较低的.在甜菜的生产过程 中,可能出现一些环境条件,能诱发植株开花或者俗称"抽苔"的现象.在甜菜的生 产中,由于提前种植低春化要求的、抽苔敏感糖甜菜品种,随后又在植株早期发育 阶段遇到寒冷条件,通常就会发生抽苔现象.此外,在之前讨论到的在田间越冬的 甜菜或亲缘植物,如果得不到控制的话,会在下个生长季抽苔.这些类型的抽苔植 物能够散布花粉,如果存在其中的一种,它就会争夺养分和水分,于是会影响根的 产量.因此,目前,采用农艺方法来控制抽苔植株. 另外,种子生产者在向市场投放新品种之前,要进行编有号码的试验,以满足 工业要求和田间表现标准.在更换抽苔敏感品种时,要进行标上编号的试验,以选 取抽苔特性较小的新栽培品种.采用这种方法,最近培育出了对于抽苔更不敏感的 品种.如果由于存在抽苔敏感的品种或者田间越冬植株,在生产甜菜根的田块里出 现了抽苔植株,即应进行田间巡查并把它们人为地拔掉.这一农艺方法加上选用抗 抽苔的新品种,能明显地减少在糖甜菜根生产时花粉散落的可能性. 1.4.4 在自然条件下与其他生物(例如微生物)进行遗传物质交换的可能性. 目前从未发现任何关于遗传物质由甜菜向其它生物传递遗传物质的报道. 1.5 生长监测方法和监控的可能性. 甜菜植株的形态早已为人们所熟悉,因此很容易监测和控制. 1.6 受体植物的其他资料. 有关甜菜的其它资料可在相关农业参考书中查到. 1.7 根据上述评价,参照本办法第十一条有关标准划分受体植物的安全等级 综上所述,甜菜对人体或者动物不具有毒性,对环境产生负面效应或者演变成 为一种有害生物的可能性极小.因此,根据《农业转基因生物安全评价管理办法》 第二章第十一条的规定,受体植物的安全等级为I. 孟山都公司申请书_H7-1 23 2 基因操作的安全性评价 2.1 转基因植物中引入或修饰性状和特性的叙述. H7-1转化体内含有来自于农杆菌小种CP4的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 (EPSPS)基因.cp4 epsps基因能编码合成由455个氨基酸单个多肽组成的47.6kD的CP4 EPSPS蛋白 (Padgette et al., 1996).此CP4 EPSPS蛋白在结构上和功能上都类似于 天然的植物源EPSPS 酶,但对于草甘膦的亲合性却明显地减少了(Padgette et al., 1996).草甘膦能结合植物EPSPS 酶,阻止芳香族氨基酸的生物合成,于是,使这些 植物缺少这些必需成分(Steinrücken and Amrhein, 1980; Haslam, 1993).但是在抗农达植 物体内,由于CP4 EPSPS酶在草甘膦存在的情况下会持续发挥作用,能满足植物生长 发育的需要,从而抵抗农达除草剂草甘瞵的危害. KWS公司同孟山都合作培育出的抗农达?甜菜品种H7-1转化体,能耐受农达农 用除草剂的活性成分草甘瞵.抗农达?甜菜品种的培育,是利用现代的生物技术,通 过把来自于天然土壤微生物农杆菌小种CP4的cp4 epsps编码序列稳定地导入甜菜基因 组里. 2.2 实际插入或删除序列的以下资料: 2.2.1 插入序列的大小和结构,确定其特性的分析方法; 插入序列包含有cp4 epsps基因表达盒,大小约为3.4kb.该表达盒包括35S 启动 子(P-FMV,大小0.672kb)、拟南芥叶绿体转移肽序列(CTP2,大小0.31kb)、cp4 epsps基因(大小1.363kb)和豌豆rbc-E9(E9 3',大小0.63kb).通过限制性核酸内切 酶的酶切和Southern印迹杂交可以确定上述表达调控元件的特性(图1,报告1). 图1为H7-1转化体的基因组中插入的线性DNA片段,该线性片段在质粒PV- BVGT08上构建见图2.分子生物学分析(图5、6、7和8)以及孟德尔遗传学数据 (表5)也支持以下的结论,即,H7-1转化体存在单一的稳定的插入片段,这一插 入片段里有导入到甜菜基因组DNA的cp4 epsps基因盒的一个完整的拷贝. 孟山都公司申请书_H7-1 24 表1. PV-BVGT08 中包含的基因组成一览表 基因成分 大小 (kb) 描述 右边界 0.025 一个作为DNA转入植物细胞的初始点的21-25 bp核苷酸,系从A. tumefaciens 质粒pTiT37分离出来(Depicker et al., 1982). P-FMV 0.672 来自于经修饰的玄参花叶病毒(FMV)的35S基因启动子 (Sheperd et al., 1987; Richins et al., 1987; Gowda et al., 1989; Sanger et al., 1990). ctp2 0.31 来自于Arabidopsis thaliana cp4 epsps 编码区的N-端点叶绿体过渡肽 序列(Timko et al., 1988). cp4 epsps 1.363 T来自于农杆菌小种CP4的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 (EPSPS) (Padgette et al., 1995). E9 3' 0.63 Pisum sativum rbcS E9 基因的3'端,含有能指挥mRNA加工和多腺苷 酸化的诸多多腺苷酸化位点 (Coruzzi et al., 1984; Morelli et al., 1985). 左边界 0.025 一个21-25bp的核苷酸序列,它能确定T-DNA转入植物细胞的边 界,最先系从 A. tumefaciens 质粒pYil5955里分离出来,系为鱆鱼碱 类质粒pTiA6 (Barker et al., 1983). ori-V 0.393 一个DNA重复的无性来源,原先从质粒PK2中分离出来(Rogers et al., 1987). ori-322 0.629 DNA重复的一个质粒来源,能使质粒保持在大肠杆菌等细菌寄主体 内(Sutcliffe, 1979). rop 0.191 质粒pBR322R 的一个片段,能抑制RNA引子的形成,而RNA引子 对于质粒能否保持在大肠杆菌等细菌寄主体内是至关重要的(Bolivar et al., 1977; Cesareni et al., 1982). aad 0.789 细菌基因,能为Tn7 AAD 3' 腺嘌呤转移酶编码,使之具有对放线 菌素和链霉素的抗性 (Fling et al., 1985). 孟山都公司申请书_H7-1 25 图1、H7-1转化体中的DNA插入序列线性示意图 ctp2 P-FMV - E 9 3' LB RB BamH I ClaI ClaI PstI PstI XbaI HindIII HindIII vector DNA hybridizing fragments: HindIII H indIII 5.2 kb XbaI XbaI 4 kb BamHI BamH I 11 kb PstI PstI PstI 4.9 kb 1.2 kb ClaI ClaI ClaI 2.4 kb E9 probe cp4 epsps probe P-FMV probe P-FMV::ctp2::cp4 epsps::E9 probe cp4 epsps ctp2 P-FMV - E 9 3' LB RB BamH I ClaI ClaI PstI PstI XbaI HindIII HindIII vector DNA hybridizing fragments: HindIII H indIII 5.2 kb HindIII H indIII 5.2 kb XbaI XbaI 4 kb XbaI XbaI 4 kb BamHI BamH I 11 kb BamHI BamH I 11 kb PstI PstI PstI 4.9 kb 1.2 kb PstI PstI PstI 4.9 kb 1.2 kb ClaI ClaI ClaI 2.4 kb ClaI ClaI ClaI 2.4 kb E9 probe cp4 epsps probe P-FMV probe P-FMV::ctp2::cp4 epsps::E9 probe cp4 epsps 孟山都公司申请书_H7-1 26 图2 PV-BVGT08 质粒载体构建示意图 2.2.2 删除区域的大小和功能; H7-1 在遗传操作过程中没有删除受体基因组序列.(报告1) 2.2.3 目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列; i) H7-1 目的基因的核苷酸序列(商业保密资料) H7-1目的基因 cp4 epsps基因:许多文献已证明该基因引入植物体后,能编码 CP4 EPSPS 蛋白,使植物耐受草甘膦类除草剂 (Padgette et al., 1996; OECD, 1999) . 已成功在大豆、玉米、棉花、油菜等多种作物上利用.cp4epsps基因的核苷酸序列见 图3. PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border ori-V rop ori-322 aad Right Border P-FMV ClaI 2406 XhoI 2389 NotI 2380 PstI 2368 BamHI 1702 KpnI 1700 SacI 1694 EcoRI 1684 SacI 1680 PstI 1151 PstI 6540 PstI 7479 HindIII 7972 SacI 7982 EcoRI 8102 EcoRI 8505 XbaI 8571 BglII 8577 HindIII 8583 ClaI 8590 HindIII 5 KpnI 814 PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border ori-V rop ori-322 aad Right Border P-FMV ClaI 2406 XhoI 2389 NotI 2380 PstI 2368 BamHI 1702 KpnI 1700 SacI 1694 EcoRI 1684 SacI 1680 PstI 1151 PstI 6540 PstI 7479 HindIII 7972 SacI 7982 EcoRI 8102 EcoRI 8505 XbaI 8571 BglII 8577 HindIII 8583 ClaI 8590 HindIII 5 KpnI 814 孟山都公司申请书_H7-1 27 图3 H7-1中cp4 epsps 基因的核苷酸序列 ii) 目的基因推导的氨基酸序列 由cp4 epsps编码序列推导出了在H7-1里的植物产生的CP4 EPSPS蛋白的氨基酸序 列,见图4. 1 MLHGASSRPA TARKSSGLSG TVRIPGDKSI SHRSFMFGGL ASGETRITGL LEGEDVINTG 61 KAMQAMGARI RKEGDTWIID GVGNGGLLAP EAPLDFGNAA TGCRLTMGLV GVYDFDSTFI 121 GDASLTKRPM GRVLNPLREM GVQVKSEDGD RLPVTLRGPK TPTPITYRVP MASAQVKSAV 181 LLAGLNTPGI TTVIEPIMTR DHTEKMLQGF GANLTVETDA DGVRTIRLEG RGKLTGQVID 241 VPGDPSSTAF PLVAALLVPG SDVTILNVLM NPTRTGLILT LQEMGADIEV INPRLAGGED 301 VADLRVRSST LKGVTVPEDR APSMIDEYPI LAVAAAFAEG ATVMNGLEEL RVKESDRLSA 361 VANGLKLNGV DCDEGETSLV VRGRPDGKGL GNASGAAVAT HLDHRIAMSF LVMGLVSENP 421 VTVDDATMIA TSFPEFMDLM AGLGAKIELS DTKAA 图4 由目的基因推导的 CP4 EPSPS蛋白的氨基酸序列 2.2.4 插入序列在植物细胞中的定位(是否整合到染色体、叶绿体、线粒体,或以非整 合形式存在)及其确定方法; 插入序列为H7-1核基因组的一部分. 通过分子分析,为H7-1内插入的DNA片段定性.利用Southern杂交分析法 (Southern, 1975)进行基因组DNA分析,以确定插入片段数(即甜菜基因组里整合位 点数目)、拷贝数目(用于一个插入位点内转化的DNA片段数目)、插入启动子、 编码区和多腺苷酸化序列等是否整合;和是否有质粒骨架序列.还进行了聚合酶链 式反应(PCR) (Saiki, 1990),以证实插入片段在5'和3'端处的序列. 这些分析支持下列结论: (1) H7-1转化体的基因组里有一个单一的DNA插入片 段,此片段由一个用于转化的cp4 epsps基因表达盒的单一拷贝构成; (2) 在单一插入 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 孟山都公司申请书_H7-1 28 位点的cp4 epsps 基因表达盒完好无损;(3) cp4 epsps基因表达盒的转录含有源自修饰 的玄参花叶病毒基因组(P-FMV)的35S基因启动子,该启动子能指挥来自于 Arabidopsis thaliana的叶绿体过渡肽(ctp2)编码序列的转录,此转录使翻译后输入叶 绿体成为可能,并且与源自农杆菌小种CP4 的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 (EPSPS) 的编码序列(cp4 epsps)融合,此DNA含有多腺苷酸化序列,这来自于 Pisum sativum (豌豆) rbcS E9 (E9 3')基因的3'非翻译区;(4)在H7-1转化体中没有 测出任何质粒骨架DNA. 通过Southern blot 杂交分析方法验证了插入的DNA及拷贝数.同时验证质粒 PV- BVGT08中各遗传调控元件,其中包括 cp4epsps 是否已转入植物基因组中.结果表 明抗农达甜菜H7-1 只有一个插入位点及单个拷贝数.Southern Blot分析图谱见图5、 图6、图7、图8、图9. 孟山都公司申请书_H7-1 29 图5. H7-1 转化体的Southern blot 分析: 插入位点及拷贝数分析 探针用32 P标记,每泳道加样量为~10 ?g经酶切的DNA,各泳道加样如下: 泳道 1 质粒PV-BVGT08(BamHI) 2 分子量标记 3 H7-1(PstI) 4 H7-1(HindIII) 5 H7-1(Xbal) 6 H7-1(ClaI) 7 H7-1(BamHI) 8 非转基因对照 9 分子量标记 Pst I Marke r Hind III Xba I Cla I Bam HI neg. Control Marker PV-BVGT08 Bam HI 5634 bp 3609 bp 2938 bp 2319 bp 1416 bp 1050 bp 7378 bp 15000 bp 4360 bp 9007 bp 803 bp 554 bp 375 bp 234 bp 1810 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 unspecific background signals 孟山都公司申请书_H7-1 30 图6. H7-1 转化体的Southern blot 分析: ctp2::cp4 epsps 编码区的完整性分析 印迹斑用32 P标记的cp4 epsps(PCR)片段进行探针检测.探针涵盖了PV-BVGT08质粒447bp至1555bp的片段. 每泳道加样量为~10 ?g经酶切的DNA,各泳道如下: 泳道 1 分子量标记 2 H7-1(HindIII/BamHI) 3 非转基因对照(HindIII/BamHI) 4 非转基因对照与PV-BVGT08质粒混合(HindIII/BamHI) 5 H7-1(Xbal) 6 非转基因对照(Xbal) 7 非转基因对照与PV-BVGT08质粒(Xbal) H 7 - 1 H 7 - 1 P V - B V G T 0 8 P V - B V G T 0 8 n e g .c o n tr o l n e g .c o n tro l M a rk e r X ba1 H indIII/Bam H I 1 2 3 4 5 6 7 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 9007 4360 孟山都公司申请书_H7-1 31 图7. H7-1 转化体的Southern blot 分析: 启动子区域完整性分析 探针用32 P标记,每泳道加样量为~10 ?g经酶切的DNA,各泳道如下: 泳道 1 H7-1(XbaI) 2 非转基因对照(XbaI) 3 非转基因对照与PV-BVGT08质粒混合(XbaI) 4 H7-1(HindIII) 5 非转基因对照(HindIII) 6 非转基因对照与PV-BVGT08质粒(HindIII) 7 分子量标记 8 分子量标记 9 H7-1(SacI/XhoI) 10 非转基因对照(SacI/XhoI) 11 非转基因对照与PV-BVGT08质粒(SacI/XhoI) 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 H7-1 H7-1 PV-BVGT08 PV-BVGT08 neg.control neg.control M arker Xba1 HindIII 1 2 9 4 5 6 7 probe: promotor-fragment probe: promotor-cp4epsps-E9`3 M arke r H7-1 PV-BVGT08 neg.control 8 3 10 11 SacI/XhoI Unspecific background signals XbaI 孟山都公司申请书_H7-1 32 图8 H7-1转化体Southern blot 分析: 多聚信号完整性 32 P标记的 E9 3'多聚片段,BamHI / XhoI酶切,相当于PV-BVGT08质粒1702 – 2389bp. H7-1, 非转基因对照,非转基因对照与PV-BVGT08质粒DNA混合,用EcoRI/PstI (泳道 2, 3 ,4)、XbaI(泳道 5, 6 ,7)、 HindIII (泳道11, 12,13)或PstI(泳道 8, 9 , 10)酶切. H7-1 H7-1 PV-BVGT08 PV-BVGT08 neg.control neg.control Marker Hind III Pst I 8 9 10 14 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 PV-BVGT08 PV-BVGT08 H7-1 7 H7-1 4 neg.control 3 2 5 neg.control 6 Marker 1 EcoRI/Pst I Xba1 1.2kb Unspecific background signals 11 12 13 XbaI 孟山都公司申请书_H7-1 33 图9H7-1 转化体Southern blot 分析: 骨架分析 H7-1, 非转基因对照,非转基因对照与PV-BVGT08质粒DNA混合,用XbaI酶切.每泳道加样量为~10 ?g经酶切的 DNA.探针包括了完整PV-BVGT08骨架(探针1-4).另外一块印迹斑为32 P标记的cp4 epsps编码序列片段 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 probe cp4epsps (=PV-BVGT08 bp 447- 1555) probe 1 (=PV-BVGT08 bp 2730-5370) probe 2 (=PV-BVGT08 bp 5278- 6419) probe 3 (=PV-BVGT08 bp 6302- 7851) probe 4 (=PV-BVGT08 bp2730- 7851) H7-1 4 H7-1 + PV-BVGT08 3 neg.control 1 Marker 6 H7-1 8 H7-1 + PV-BVGT08 7 neg.control 5 Marker 14 H7-1 H7-1 + PV-BVGT08 15 neg.control 13 Marker 10 H7-1 12 H7-1 + PV-BVGT08 11 neg.control 9 Marker 18 H7-1 20 H7-1 + PV-BVGT08 17 Marker neg.control 19 16 2 孟山都公司申请书_H7-1 34 插入序列的拷贝数: Southern 杂交分析表明H7-1转化体含有一个拷贝的插入序列. 理论上讲,一个整合位点有可能含有多于一个的插入DNA拷贝.但是从限制性 酶切获得的片段的大小可以推测(图1),含有多于一个拷贝数的可能性是没有的. 如果在H7-1里存在插入DNA的多于一个的拷贝,应可能检测出其它的附加片段.用PstI对插入片段的限制性酶切证实了这一推断(图5).在T-DNA里,在左边界和右 边界序列之间,PstI 产生了二次酶切(图1),其中一个限制性酶切位点在cp4 epsps编 码区域内,所以,在用PstI酶切之后,预计利用cp4 epsps探针能检测到二个杂交片 段.一个预期的片段应对应于约为1.2kb的内部片段,而第2个片段应含有一个带有甜 菜基因组的融合区.再者,假如有多于一个的拷贝,理应检出其它附加的片段.利用PstI酶切的结果表明,不出所料,PstI能切割DNA,1.2kb的内部片段和约为4.9kb 的另一个唯一的片段都检测到了 (图5, 泳道3),这证实了在H7-1转化体里只插入了 DNA的一个拷贝. 对来自于H7-1 的DNA , 利用ClaI 进行了酶切.在插入的P-FMV::ctp2::cp4 epsps::E9 3' 基因盒里,ClaI 酶切二次 (图5, 泳道 6).正如预期的,只有一个2.4kb的 单一片段同cp4 epsps探针杂交.这一结果还表明了整合DNA片段的完整性. 2.3 目的基因与载体构建的图谱,载体的名称、来源、结构、特性和安全性,包括载 体是否有致病性以及是否可能演变为有致病性. 目的基因与载体构建的线性图谱和环形图谱分别见图1和图2.目的基因cp4 epsps和质粒PV-BVGT08的左边界(LB)和右边界(RB)组成完整地cp4 epsps基因 盒, 该基因盒包括玄参花叶病毒(FMV)的35S基因启动子、来自在拟南芥 cp4 epsps 编码区的N-端点叶绿体转移肽序列ctp2 、来自于农杆菌小种CP4的5-烯醇丙酮酰莽草 酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)以及豌豆 rbcS E9 基因的3'端,见表 1. 在T-DNA之外,PV-BVGT08质粒的其它组成调控元件描述如下,这些调控元件 均没有被转入H7-1转化体内: ori-V:大小0.393 kb,最初从质粒RK2分离而来 (Rogers et al., 1987),是无性重 复DNA序列,使质粒保持在农杆菌内. ori-322:大小0.629 kb,DNA重复的另一个来源,能使质粒保持在大肠杆菌等细 菌寄主体内 (Sutcliffe, 1979) . Rop:大小0.191 kb,最初从质粒pBR322R中分离而来,能使质粒保持在大肠杆 菌等细菌寄主体内 (Bolivar et al., 1977; Cesareni et al., 1982). Aad:大小0.789 kb,来自细菌转座子Tn7,编码链霉素腺苷酸转移酶,使之具有 对放线菌素和链霉素的抗性 (Fling et al., 1985) 2.4 载体中插入区域各片段的资料 孟山都公司申请书_H7-1 35 用于产生抗农达甜菜H7-1的质粒载体是PV-BVGT08.通过分子生物学分析H7-1 转化体表明,插入序列只有一个拷贝的cp4 epsps基因盒,不含其它遗传元件(表2).cp4 epsps基因盒包括一个P-FMV启动子、CTP2转运肽序列、目的基因cp4 espsp 编码序列以及多腺苷化序列E9 3'终止子. CTP2转运肽序列:协助CP4 EPSPS蛋白向叶绿体转移.草甘膦在植物体内的靶 标酶 5-烯醇式-3-磷酸转移酶(EPSPS)在叶绿体内.许多叶绿体蛋白包括EPSPS由 核基因编码表达,由CTP转运肽导向叶绿体.而非叶绿体蛋白与CTP结合到一起,也 可以使这种蛋白质导向叶绿体,这种表达、转运方式在植物体内(Timko et al., 1988) 和植物体外 (della-Cioppa et al., 1986 and 1987) 都得到证明.CP4 EPSPS 蛋白是一个 细菌蛋白,不含CTP,因此将来自拟南芥的ctp编码序列 (Klee et al., 1987) 与cp4 epsps 基因结合在一起,以转运CP4 EPSPS 蛋白到叶绿体.为了达到这个目的,将拟南芥 的ctp编码序列进行了改造并命名为ctp2. 表2. H7-1转化体插入片段分析小结 基因成分 拷贝数目 P-FMV::ctp2::cp4 epsps::E9 3' 盒 一个拷贝 ori-V 无ori-322 无aad 无在T-DNA之外的其它主链序列 无2.4.1 启动子和终止子的大小、功能及供体生物的名称 用于产生抗农达甜菜H7-1的质粒载体是PV-BVGT08,用于转化的启动子P-FMV 和终止子E9 3'的大小及功能详见表1.并分述如下: P-FMV启动子:35S基因启动子控制着ctp2::cp4 epsps 编码区转录的启动.这个 来自被修饰的玄参花叶病毒(FMV)的启动子在植物体内具有结构活性 (Sheperd et al., 1987; Richins et al., 1987; Gowda et al., 1989; Sanger et al., 1990).它位于一个0.672 kb DNA片段上,该片段位于ctp2::cp4 epsps编码区的5'端 (表1、图2).这个启动子还 被用来调控其它抗农达作物里同一编码区的转录,这些抗农达作物,包括棉花(95- 023-01p)、甜菜77转化体(98-173-01p)和油菜(98-216-01p)已经通过USDA审查 并授予了非监控资格. E9 3'多腺苷酸化位点:多腺苷酸化位点能指导mRNA的加工和复合腺苷酸的添 加.P-FMV::ctp2::cp4 espsp::E9 3'基因盒里有一个来自于Pisum sativum (豌豆) rbcS E9基因3'端的0.63kb的DNA 片段,用来提供这些多腺苷酸化位点 (Coruzzi et al., 1984; Morelli et al., 1985)(表1、图2).这同一个DNA区被用作其它抗农达作物里同 一编码区的多腺苷酸化信号,这些抗农达作物,包括棉花(95-023-01p)、甜菜77转 化体(98-173-01p)和油菜(98-216-01p)已经USDA审查并给与了非监控批准. 2.4.2 标记基因和报告基因的大小、功能及其供体生物的名称 孟山都公司申请书_H7-1 36 PV-BVGT08质粒含有选择性0.789kb的标记基因aad,使之对抗生素放线菌素和 链霉素产生抗性.但抗生素标记基因在质粒上处于T-DNA之外,并未被转化到H7-1 基因组内.H7-1也不含其它报告基因. 2.4.3 其它表达调控序列的名称及其来源(如人工合成或供体生物名称) H7-1 含有一个CTP2转运肽序列:协助CP4 EPSPS蛋白向叶绿体转移.草甘膦 在植物体内的靶标酶 5-烯醇式-3-磷酸转移酶(EPSPS)在叶绿体内.许多叶绿体蛋 白包括EPSPS由核基因编码表达,由CTP转运肽导向叶绿体.而非叶绿体蛋白与CTP 结合到一起,也可以使这种蛋白质导向叶绿体,这种表达、转运方式在植物体内 (Timko et al., 1988) 和植物体外 (della-Cioppa et al., 1986 and 1987)都得到证明.CP4 EPSPS 蛋白是一个细菌蛋白,不含CTP,因此将来自拟南芥的ctp编码序列 (Klee et al., 1987) 与cp4 epsps基因结合在一起,以转运CP4 EPSPS 蛋白到叶绿体.为了达到 这个目的,将拟南芥的ctp编码序列进行了改造并命名为ctp2. 2.5 转基因方法 H7-1转化体是应用农杆菌介导转化法而培育出的甜菜品系.农杆菌介导转化法 是一种广为应用的基因转导方法,用于把外源DNA转移和整合入植物染色体基因组 (White, 1989; Howard et al., 1990). 从二倍体甜菜品系3S0057的灭菌苗衍生的子叶,用作外植体来源.这些子叶浸 于农杆菌悬液里,协同培养2至4天.然后转移到含有500mg/l羧苄青霉素的选择性培 养基里,以灭活农杆菌.利用草甘膦选择抗草甘膦组织,该组织里含有赋与草甘膦 抗性的基因插入片段,命名为H7-1转化体.在大约7周之后,发育起来的小植株即转 移到生根培养基上,并置于温室中培养、生长、发育、结实. H7-1基因转化过程见图10. 孟山都公司申请书_H7-1 37 农杆菌CP4株系 图10 抗草甘膦甜菜转化体H7-1的转化过程 含cp4 epsps基因甜菜植株再生,转化体命名为H7-1 草甘膦筛选含有cp4 epsps基因的转化细胞 利用农杆菌介导转化系统转化甜菜品系3S0057 组装PV-BVGT08质粒载体 甜菜H7-1植株田间农艺性状评价 cp4 epsps 基因盒 甜菜H7-1转化体植株评价 抗农达甜菜H7-1 孟山都公司申请书_H7-1 38 2.6 插入序列表达的资料: 2.6.1 插入序列表达的器官和组织,如根、茎、叶、花、果实、种子等; 利用双抗体三明治ELISA法(double-antibody sandwich ELISA),测定了叶(尖 )和经处理的根(brei)组织的提取液样品里CP4 EPSPS蛋白含量,此法采用了小 鼠单克隆抗CP4 EPSPS抗体作为俘获抗体,山羊的多克隆抗体抗CP4 EPSPS与辣根 过氧化物酶(HRP)共轭作为检测抗体.添加辣根过氧化物酶,TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidene)进行着色.通过样本吸收率(OD)和各种浓度的大肠杆菌产 生的CP4 EPSPS蛋白参照标准进行对比,估测植物组织提取液里CP4 EPSPS蛋白的 含量.利用一个表达农杆菌小种cp4 epsps基因的大肠杆菌小种,纯化了CP4 EPSPS 蛋白标准.此蛋白标准此前已经定性 (Harrison et al., 1996) . 1999年,在欧洲的主要甜菜产区的6个不同田间试验点,进行了田间试验.利 用农达除草剂,对H7-1甜菜进行处理.收集了brei(按照标准甜菜工业方法加工的 根组织)和(叶)尖组织,采用ELISA法分析了CP4 EPSPS的含量.按鲜重计算, CP4 EPSPS蛋白的平均浓度,在叶组织里(161 ?g/g)和在根组里(181 ?g/g)是相近 的.在各个试验点,CP4 EPSPS蛋白的平均含量值阈,在(叶)尖里为112- 201?g/g,在根(brei)里为145-202?g/g.(表3、报告2) 表3 H7-1组织中CP4 EPSPS蛋白含量小结 组织类型 CP4 EPSPS 蛋白 (?g/g 组织鲜重) 叶片1 平均2 值域3 161 112 - 201 Brei4 平均2 值域3 181 145 - 202 :注: 1 从30个H-71植株上选取了一个面积约为5-10cm2 的叶面,作为一个重复.每个试验点收集3个重 复.收集的叶片放入锥型管里,置于干冰上,送到试验室. 2 每个田间试验点各提供3个植物重复样本,对它们进行了分析,计算出了平均值. 3 各现场试验点进行样本分析得到的平均值域.其中(叶)尖n = 6个现场试验点,根(brei) n = 6现场试验点. 4 Brei系由一个法国试验室(AGREN)采用制材机械制备.样本立即在干冰上结冻,然后 储存在–80°C下,直到分析使用. 孟山都公司申请书_H7-1 39 2.6.2 插入序列的表达量及其分析方法 采用ELISA (酶联免疫反应) 分析方法检测了地上部及地下根组织中CP4 EPSPS的表达,按鲜重计算,CP4 EPSPS蛋白的平均浓度,在叶组织里(161 ?g/g)和 在根组里(181 ?g/g)是相近的.在各个试验点,CP4 EPSPS蛋白的平均含量值阈, 在(叶)尖里为112-201?g/g,在根(brei)里为145-202?g/g.(2.6.1,表3,报告 2).ELISA分析方法如下: CP4 EPSPS蛋白酶联免疫反应的检测是采用电脑智能控制进行操作(Tecan, Research Triangle Park, NC).CP4 EPSPS 小鼠抗体在缓冲液(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, and 150 mM NaCl, pH 9.6)中被稀释并固化在96孔培养板上(浓度为 1.0 ?g/ml),在4 ?C的冰箱培养约8小时后用稀释1倍的 PBS 0.05% (v/v) Tween-20 (1X PBST)进行冲洗,再用含脱脂干奶粉的TBA进行封闭,在每孔加入100?l标准 CP4 EPSPS 蛋白或样品之前再次冲洗,然后在摄氏37度下培养1小时.再次冲洗培 养板后每孔加入100?l 山羊抗CP4 EPSPS过氧化酶偶合物,并培养1小时,并加入辣 根过氧化酶物底物3,3',5,5'- tetramethyl-benzidine (四甲基联苯胺).最后在每孔中 加入100 ?l 6 摩尔的磷酸终止酶反应.CP4 EPSPS 的含量可以从标准样品(浓度为 0.456 - 14.6 ng/ml)的曲线中找到相应的值. 2.6.3 插入序列表达的稳定性 利用Chi—方检验分析了不同世代、不同杂交组合抗农达性状的后代分离情 况,结果表明目的基因不同世代分离通过Chi—方检验,没有统计学上的明显差异 (表5),这同时证明了目的基因稳定地在不同世代表达,其分离符合孟德尔遗传 规律,进一步证明了单一基因位点单拷贝的转化结果. 为了进一步证实目的基因已作为一个插入片段稳定地整合进甜菜H7-1基因 组,采用Southern杂交法分析了H7-1转化体及其后三代中提取的基因组DNA.最初 的转化体植株H7-1(6401VH)及其3个后代 (64801H、 74922H和83002S)进行了比 较. 这三个后代是H7-1经自交或与非转基因甜菜品系杂交而得到的后代(图11、 表4).除此之外,还利用了四个不同的非转基因甜菜品系作为对照,进行 Southern 杂交分析,这四个品系分别是3S0057, 5R7150, 8K1180 和6S0085, 其中 5R7150 是对照1,8K1180 是对照2、6S0085是对照3、3S0057是对照4.利用XbaI、 HindIII和BamHI对各系的DNA进行了酶切,并同标记cp4 epsps片段进行了杂交.如果T-DNA稳定地整合进入了植物基因组,那么,被同一个限制酶降解的H7-1的所 有后代应在电泳上显示出一个同样大小的片段. 来自于H7-1后代的DNA(图12,泳道3至6)产生了预期大小的片段:用BamHI降解的DNA产生了一个约为11.0kb大小的片段, 用XbaI降解产生了一个4.0kb 大小的片段, 用HindIII降解产生了一个5.2kb大小的片段.同样的降解产生的各种杂 交片段,除了DNA材料是来自于不同后代之外,在分子重量和迁移率上具一致 性,证明T-DNA已经稳定地整合进入植物基因组.非转基因对照系都没有产生同 样的杂交谱带(图12,泳道1、2、7和8).在H7-1转化体的诸多世代的电泳图谱 特征,没有观察到任何的显著差异.这些结果证明了不同世代间插入DNA的稳定 性.(报告1) 孟山都公司申请书_H7-1 40 3S0057 (nontransgenic line, single multigerm genotype) transformation and cloning 6401VH x CMS-MO females(1) multiplication crossing(2) under isolation, selection with glyphosate 64037G 64038G selfing(2) 64801H x CMS-MO females(1) 74906H 74908Hselfing(2) selfing(2) crossing(2) 74922H x CMS-MO females(1) 74901H x CMS-MO females(1) 74401G 74022G crossing(2) selfing(3) crossing(2) selfing(2) 84507G 83002S 74922H x CMS-MO females(1) 80501A, 80502A, 80503A 80504A, 80505A, 80506A crossing(3) 80507A selfing(2) 90106J, 90107J, 90539A 94901H 90540A, 90541A, 90542A 90543A, 90544A, 90545A 图11 H7-1 选育是及其后代分离系谱 注: (1)单胚甜菜材料(MO).细胞质雄性不育植物(CMS). (2)分离后代.利用农达除草剂选择转基因植物. (3)分离后代.利用PCR法,识别转基因植物. 孟山都公司申请书_H7-1 41 表4 转化体稳定性分析中应用的H7-1甜菜后代品系目录 H7-1转化体植株 (品系代号) 研究目的 6401VH, 64801H, 74901H, 74922H, 83002S 分子定性,遗传分离数据. 74022G 成份构成数据(1999* 田间试验),蛋白表达数据 (1999*). 80503A 成份构成数据(1999* 田间试验),蛋白表达数据 (1999*). 80502A, 80504A, 80505A, 80506A, 80507A 构成数据(1999),蛋白表达数据 (1999*),遗传分离数据 94901H, 90106J, 90107J, 90539A, 90540A, 90541A, 90542A, 90543A, 90544A, 90545A 遗传分离数据 注: * 表示进行研究的年份或者进行田间试验的年份,这个数据可能和图11显示的制种年份不一致 孟山都公司申请书_H7-1 42 表5抗农达甜菜转化体 H7-1 不同世代分离模式 亲本 % 抗农达株2 Chi-square test 世代 供试品系 母本 1 父本 株数 观察值 期望值 Chi test value 显著性3 备注 1 64037G 3A0047 MO 6401VH H7-1 62 51.6 50 0.10 NS 1 64038G 3A0064 MO 6401VH H7-1 44 63.6 50 7.40 * Few tested plants 5 1 64801H 6401VH H7-1 6401VH H7-1 77 67.5 75 3.00 NS 2 74022G 4E0006 MO 64801H H7-1 300 63.0 67 0.72 NS 2 74401G 4E0006 MO 64801H H7-1 400 65.3 67 0.13 NS 2 74901H 64801H H7-1 64801H H7-1 1052 84.1 87 0.74 NS 2 74906H 64801H H7-1 64801H H7-1 470 94.7 87 5.24 * Few pollinator plants 5 2 74908H 64801H H7-1 64801H H7-1 65 81.5 87 2.67 NS 2 74922H 64801H H7-1 64801H H7-1 2640 83.1 87 1.34 NS 2 74922H 64801H H7-1 64801H H7-1 7508 37.5 5 34 0.72 NS Homozygous plants selected by PCR 3 84507G 2A0011 MO 74901H H7-1 462 48.7 50 0.07 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80501A 6E0077 MO 74922H H7-1 460 65.2 67 0.15 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80502A 6A3971 MO 74922H H7-1 461 61.6 67 1.32 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80503A 6J0006 MO 74922H H7-1 460 65.7 67 0.08 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80504A 5J9101 MO 74922H H7-1 459 66.4 67 0.02 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80506A 7A3774 MO 74922H H7-1 459 59.1 67 2.82 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80507A 6A2695 MO 74922H H7-1 449 54.1 67 7.53 * Homozygous + Heterozygous H7-1 Timing of pollination5 续表5 抗农达甜菜转化体H7-1的世代分离模式 孟山都公司申请书_H7-1 43 亲本 % 抗农达株2 Chi-square test 世代 供试品系 母本 1 父本 株数 观察值 期望值 Chi test value 显著性3 备注 4 94901H 74922H H7-1 74922H H7-1 616 76.3 4 75 0.09 NS After selection of heterozygous plants 4 90106J 6J0006 MO 74922H H7-1 616 53.1 50 0.38 NS 4 90107J 8J0029 MO 74922H H7-1 616 52.6 50 0.27 NS 4 90539A 6A3973 MO 74922H H7-1 616 55.2 50 1.08 NS 4 90540A 8A3871 MO 74922H H7-1 616 52.1 50 0.18 NS 4 90541A 8J0023 MO 74922H H7-1 616 51.3 50 0.07 NS 4 90542A 5J9101 MO 74922H H7-1 616 54.9 50 0.95 NS 4 90543A 6J0042 MO 74922H H7-1 616 47.7 50 0.21 NS 4 90544A 6E0076 MO 74922H H7-1 616 46.4 50 0.51 NS 4 90545A 7J0047 MO 74922H H7-1 616 49.5 50 0.01 NS 注: 1 MO: 单胚甜菜品系. 2 温室内用12 l/ha农达除草剂喷施,选择纯合及杂合抗农达植株 3 NS: 统计学差异不显著; *: 统计学差异显著,显著性水平 p=0.05 4 利用PCR分子标记选择纯合/杂合抗农达植株. 5 由于试验群体比较小,用于生产种子的授粉株也比较少以及授粉时间等因素存在,这些偏差是允许的.. 44 图12 H7-1 转化体Southern blot 的分析: 世代稳定性分析 注: 10 ?g转化体H7-1基因组DNA,最初转化体6401VH (H7-1 – 1995),三个后代64801H (H7-1 – 1996)、74922H (H7-1 – 1997)和83002S (H7-1 – 1998)]及非转基因对照DNA用BamHI, XbaI 和HindIII进行酶切.印迹斑用32 P标记的cp4 epsps探针(相当于PV- BVGT08质粒447bp-1555bp)进 行探测. XbaI HindIII neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980bp 9007 4360 neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI Unspecificbackgroundsignals BamHI unspecific background signals 孟山都公司申请书_H7-1 45 总之,针对H7-1转化体进行的各种观察与研究,包括Southern杂交分析和以表现 型观察为基础的分离数据,都是相互一致的,证明了cp4 epsps 基因按照孟德尔单基 因遗传方式遗传.用Southern杂交分析证实的插入片段的分子稳定性,已通过三代的 结果得到了证明.这些结果和上述的遗传稳定性数据以及分子生物学的分析结果相一 致. 2.7 据上述评价,参照本办法第十二条有关标准划分基因操作的安全类型. 如上描述,基因操作使受体增加草甘瞵抗性特征,对人类健康和环境安全没有不 利影响,按照《农业转基因生物安全评价管理办法》第十二条基因操作安全性划分标 准,该基因操作安全性为类型2,即:"不影响受体生物安全性的基因操作".根据以 上描述的基因操作,并没有增加产品品种或降低受体生物的安全性,属于类型2 (不 影响受体生物安全性的操作). 孟山都公司申请书_H7-1 46 3. 转基因植物的安全性评价 3.1 转基因植物的遗传稳定性 H7-1转化体里的目的基因稳定地单位点单拷贝整合进甜菜基因组,在后代中按照 孟德尔遗传方式稳定遗传.采用Southern杂交法分析了从H7-1转化体及该系的后三代 中提取的基因组DNA.结果表明,在H7-1转化体的诸多世代中提取的DNA之间,在 泳道特点上,没有观察到任何的显著差异,而阴性对照没有类似的杂交特征,这些结 果证明了在整个的三代里插入DNA的稳定性.详见2.6.2关于插入序列表达的稳定性 分析. 3.2 转基因植物与受体或亲本植物在环境安全性方面的差异: KWS公司于1998-1999年在德国对抗农达甜菜H7-1和非转基因对照品种通过田间 试验评估,结果表明:H7-1和非转基因对照在形态学特征、生长发育、开花习性等方 面没有明显差异,证明H7-1和非转基因对照在环境安全方面实质等同(报告3). 3.2.1 生殖方式和生殖率 与常规甜菜一样,转基因甜菜H7-1也是二年生作物,但在一定条件下,它也可一 年生.糖甜菜植株在第一年长出一个大型多汁的直根,第二年长出种柄.一般来讲, 甜菜根作物在春季播种,当年秋季收获.但是,对于种子生产来说,糖甜菜需要一个 在4-7?C下的越冬阶段(春化),以使根能在下一个生长季里抽苔,启动生殖阶段 (CFIA, 2002).抗农除草剂性状的导入没有改变甜菜的生殖方式. 在1998-1999年欧洲田间试验中,将H7-1转化体、非转基因对照及常规育种品系 的13 表现型和发育特征性状进行了比较,以评价cp4 epsps 基因的引入是否带来非预 期效应.试验中分析了花序的分枝类型(分枝型品系)、抽薹期(50%植株花序主 枝>10cm)、开花期(50%植株二级分枝开花)、发育早晚分级(综合考虑开花期、 收获期,将发育状况分为6个级别,其中1级为极早,6级为极晚)、千粒重(TWK, 通过测200粒重计算得出)、收获后种子的发芽率(在KWS种子质量检测实验室完 成),这些性状与可以反映甜菜的生殖方式和生殖率. 尽管在不同品系之间确实观察到某些性状存在差异,但这都是意料之中的.因为 不同品系间的遗传基础具有很大影响.如花序分枝特性的观察.试验还观察到H7-1、 对照和常规品系在种子发芽率上的差异可能是由于种子生产过程中的不同的环境条件 造成的.这些种子是1993年在意大利生产的,其中对照是在适宜的大田条件下,而H7-1是在温室天条件下.而其它几个常规育种品系是于1992-1998年间,在土壤气候 条件不一致的情况下生产的.千粒重的差异也是如此.但是观察值都在常规甜菜品系 值域内.其它反映植株生殖状况的指标如:春化期、抽薹期、种子收获期、植株发育 状况分级,都表明H7-1和对照在生殖方式和生殖率上没有明显差异.(表6) 表6 H7-1转化体与非转基因品系的花序及开花特性比较分析 常规品系 孟山都公司申请书_H7-1 47 注: 1 在种子生产后多点监控期间,发现有活力的种子在监控开始第一天或第二天就开始发芽,这在不同 年份、不同环境条件下观察到的休眠期一致. 2 6个水平分级标准 (1- 极早 — 6- 极晚). 3.2.2 传播方式和传播能力 在开花期间,产生的花粉粒为圆形,具有许多凹陷.每个花药的花粉粒数估计约 为17000个,花粉生活力最长只有24小时,其长短取决于环境条件,特别是湿度.花 粉主要通过风力传播,通过蜜蜂等昆虫传播的情况则要少得多(OECD, 2001). 子房形成果实,座落在花被基上.每个果实内有一粒种子,其形状有圆形的,也 有肾形的.子房由花簇常见的花托包裹着.在开单花时,形成单粒种子.两朵花或更 多的花组成的花簇,能形成多粒甜菜种子(CFIA, 2002). 甜菜属以二倍体、四倍体和六倍体的形式存在,其染色体的数目为x=9.从二十 世纪七十年代以来种植的甜菜,大多数品种为三倍体杂交种.细胞质雄性不育 (CMS)的发现,及其与多倍体的共同应用,使人们得以培育出了杂交甜菜.利用 CMS系形成三倍体杂交种的育种计划,使人们得以培育出超级甜菜品种,其块根产 量高,含糖量高,榨汁产量好(汁纯度),种子萌发率高,抽"苔"倾向小,其根的物 理特性十分适合机械采收,对叶部病害的抗性较高 (OECD, 2001) . 在1998-1999年试验中,对转基因H7-1及非转基因对照品系反映花粉发育的花药 重、每花花药数、每花药花粉数、花粉萌发率等特性进行了比较评价,认为排除气 候、环境因素影响,转基因和非转基因之间没有明显差异.此外也分析了雌性器官的 一致性,这些性状可以说明外源抗除草剂基因的引入没有改变甜菜的传播方式和传播 能力.(表7,报告3) 表7 H7-1与非转基因对照品系花药、花粉、胚珠形态的一致性 性状 H7-1 常规品系 备注 植株特性 H7-1转化体 非转基因 对照 10-12 多子粒品系 Multicarp Lines 10-12 单子粒品系 Monocarp Lines 花序 分枝类型 主枝1个,二级分枝 20–30个,每个二级 分析有 1–5 个三级 分枝 主枝1个,二级分枝 25-35个,每个二级 分析有 1–5 个三级 分枝1 主枝1个,二级分枝 12-60个,每个二级 分析有 1–10 个三 级分枝 主枝1个,二级分枝 28-74个,每个二级分 析有 1–10个三级分 枝 千粒重 (g) 14.8 – 17.4 20 – 26 14 – 28 8 – 15 种子发芽率 (%) 50 – 95 95 45 – 95 35 – 90 种子休眠期1 未观察 未观察 未观察 未观察 春化期 12 weeks 12 weeks 12 weeks 12 weeks 抽薹期 72 days after planting 70 days after planting 63 – 72 days after planting 61 – 68 days after planting 开花期 98 days after planting 98 days after planting 86 – 106 days after planting 80 – 100 days after planting 种子收获期 156 days after planting 156 days after planting 141 – 156 days after planting 141 – 156 days after planting 植株发育分级2 5 5 1 – 6 1 – 5 孟山都公司申请书_H7-1 48 非转基因对照1-6个多子粒 品系 1-6个单子粒 品系 每花药重(mg) 0.2(0.2-0.3) 0.3(0.2-0.3) 0.3(0.2-0.5) 0.3(0.2-0.4) 不同成熟期有差异 每花花药数 (平均值) 4.8(4.6-4.9) 4.9(4.7-5.0) 4.9(4.8-4.9) 4.6(4.4-4.7) 每花雄蕊数 5 5 5 5 花粉直径 (μm)* 19.9(17.8- 21.5) 21.7(20.2- 21.5) 20.8(19.4- 21.6) 20.4(17.9- 22.0) 每花药花粉数49118 52254 54971 49670 花粉萌发率(%) 5.3(1.9-17.5) 8.6(0.7-18.9) 9.2(0-17.5) 0.1(0-0.4) 不同成熟期有差异 平均花粉管长度(μm) 65.8(17.9- 144.0) 31.1(19.4- 55.2) 57.1(25.7- 123.8) 48.4** 不同成熟期有差异 每子房胚珠数(平均值) 1.0(1.0-1.0) 1.0(1.0-1.0) 1.1(1.0-1.3) 1.3(1.0-2.0) 胚珠长度(mm)* 0.7(0.7-0.8) 0.8(0.7-1.1) 0.6(0.5-0.7) 0.6(0.5-0.7) 不同成熟期有差异 胚珠宽度(mm)* 0.5(0.5-0.6) 0.6(0.5-0.6) 0.5(0.4-0.5) 0.5(0.4-0.6) 胚珠长/宽比 * 1.3(1.3-1.4) 1.5(1.3-2.0) 1.3(1.2-1.5) 1.3(1.2-1.4) *开花前测定 **只测定了一个单子粒品系的平均花粉管长度 3.2.3 休眠期 甜菜拥有长寿命的休眠种子,它们在甜菜地里可以长成自生杂草(H?jland 和Pedersen, 1994).它们一般比种植的甜菜种子晚发芽1到3天(H?jland 和Pedersen, 1994).甜菜种子可以在土壤中保持十年甚至更久,但仍然拥有发芽力(OECD, 1993b; Brouwer et al., 1976; Lysgaard, 1991).人们一般认为,六年龄的多粒种子和四年龄的 单粒种子,能展现出同样是70%的发芽率.八年龄的甜菜种子已证明能在实验室的条 件下达到59%的发芽率.发芽率取决于种子的质量和萌发的条件.甜菜能够产生一个 活力种子库(H?jland和Pedersen, 1994).甜菜的种球能抗盐水,所以,大洋河流能把繁 殖体运送到相对较远的地方.在高潮水位线以上时,大风可以把它们吹过海岸线,甚 至有时到达内陆(Smart, 1992). 由于商用产糖的甜菜是二年生,但在营养阶段的时期即第一年就采收,所以有性 繁殖器官(花器官)从来没有发育起来.倾向于生长期的第一年就抽苔的品种会产生 某些问题,因此人们目前已投入了大力,以使现有栽培品种,限制抽苔.当甜菜是为 生产种子而种植时,某些种子可能在作物采收后还留在田间.在农业实践中,人们倾 向于限制这些野生苗的生长. 3.2.4 适应性 全世界目前约30%的精制糖是用糖甜菜生产的(FAO, 1999).在美国,糖甜菜(Beta vulgaris)是一种重要的作物,在2001年和2002年的生长季里分别种植了130和140万英 亩(USDA-NASS, 2002),其产量相当于世界产量的10%.在2000-2001生长季里,美国 孟山都公司申请书_H7-1 49 的甜菜产量的价值为10.25至11.13亿美元(USDA-NASS, 2003a). 糖甜菜是一种温带二年生根作物,主要种植在美国的相对干燥凉爽的地区.对于 糖甜菜的生产来说,是在春季播种,而对于种子生产来说,则要秋季播种,以使植株 在产生种子之前经过一个春化的过程.在秋季进行糖甜菜根的采收,以加工成食糖和 做饲料用的糖蜜和糖渣.收获的甜菜根,依据种植者和加工厂签订的合同,主要运到 加工厂.整个的甜菜块根可以在采收当时进行加工,也可以在寒冷的条件下储存等待 加工.在2000年到2001年之间,有大约1700到1900公吨由糖甜菜生产的糖向国外出 口,出口价植分别约为80至60万美元.与此同时,在2000年至2001年分别出口了大约 600000到675000公吨的甜菜渣,其价植约为7670到8680万美元(USDA-FAS, 2002). 1998-1999年欧洲试验中比较了转化体H7-1常规品系胚轴颜色、叶色、叶绿素缺 陷、叶型、根型、根色、根瘿等形态学特征,这些特征能够基本代表甜菜植株的田间 长势,因此能反映转基因植株的适应性.观察结果表明转基因与常规品系的适应性是 一致的.(表8,报告3) 表8 转化体H7-1与常规品系的形态学特征 性状 H7-1 非转基因品系 R01 12个多子粒品 系12个单子粒品 系 胚轴颜色 100%绿色 100%绿色 绿、红绿、红 叶色 暗绿 暗绿 暗淡-暗绿 暗淡-暗绿 叶绿素缺陷 无无无无叶型(长/宽) 1.82 1.92 1.76-2.18 1.54-2.16 根型 卵圆形 卵圆形 卵圆形 卵圆形 根色 白色-浅棕色 白色-浅棕色 白色-浅棕色 白色-浅棕色 根瘿 无无无无其它生长缺陷 无无无无2001-2002年试验中又比较了转化体H7-1与常规品系农艺性状,这些性状包括植 株活力、bolters (%) 、出苗率和农艺性状(产量、含糖量及产糖量)结果表明H7-1与 对照品系观察值相当.(表9) 表9. 转化体H7-1与常规品系农艺性状比较 孟山都公司申请书_H7-1 50 2000 Trial Data1 品种 活力 抽薹率 出苗率 产量 含糖量2 产糖量2 描述 1 to 5 % 平均值 吨/英亩 磅/吨磅/英亩 Beta 6447 1.57 0.00 57.5 24.46 345.41 8398.89 Crystal 222 1.61 0.03 68.1 24.85 324.39 8010.49 Hillesh?g Blazer 1.68 0.00 60.9 24.55 331.08 8072.54 Van der Have H66156 1.46 0.03 51.6 26.29 323.78 8445.65 Beta 991 RR3 1.39 0.03 53.7 27.59 341.42 9348.33 Beta 992 RR3 1.17 0.00 56.6 25.51 325.57 8249.37 C.V.4 10.68 NA 10.68 4.99 3.55 5.36 LSD5 (0.05) 5.1 NA 5.10 0.99 7.32 362.57 2001 Trial Data1 品种 活力 Bolters 出苗率 产量 含糖量2 含糖量2 描述 1 to 5 % 平均值6 吨/英亩 磅/吨磅/英亩 Beta 6447 1.41 0.00 NA 22.72 322.60 7344.44 Crystal 817 1.28 0.00 NA 23.95 324.63 7783.20 Hillesh?g Blazer 1.84 0.06 NA 22.39 302.48 6781.31 SX Monarch 1.10 0.00 NA 24.07 302.60 7296.65 Beta 991 RR3 1.10 0.19 NA 25.85 316.82 8191.92 Beta 1092 RR3 0.98 0.06 NA 23.15 307.69 7126.14 C.V.4 27.37 NA NA 5.19 3.59 5.99 LSD(0.05) 0.37 NA NA 1.2 10.2 484.46 注: 1 结果来自官方编号、American Crystal Sugar 公司操作的试验. 2 可回收糖用磅/吨甜菜根或磅/每英亩表示 3 Beta 991 RR, Beta 992 RR and 1092 RR 含有 H7-1转化体. 4 变异系数. 6 2001 年试验没有数出苗率. 3.2.5 生存竞争能力 前述章节已经提到,由于商用产糖的甜菜在营养阶段的时期即第一年就采收,所 以有性繁殖器官(花器官)根本不能发育起来.少数人认为在生长期的第一年就抽苔 的品种不利于生产应用,目前有人也通过育种途径,培育不易抽苔的品种.在甜菜的 制种生产中,某些种子可能在作物采收后遗留田间.但在农业实践中,人们倾向于限 制这些野生苗的生长. 根据田间试验结果,H7-1与非转基因之间在生殖方式和生殖率(花序和开花特 性)、传播方式和传播能力(花药、花粉特性及胚珠特性)、休眠期、适应性(形态 学和农艺性状比较)等生物学特性上没有明显差异(表6、7、8、9),因此H7-1转化 体不会影响甜菜的生存竞争能力. 3.2.6 转基因植物的遗传物质向其他植物、动物和微生物发生转移的可能性 孟山都公司申请书_H7-1 51 与糖用甜菜近缘植物的异交 糖甜菜主要通过风媒传粉和有限的虫媒传粉.在授粉期间,甜菜被认为是强烈的 自我不亲和性植物,这是由于其柱头在花开时尚未完全成熟(OECD, 2001),于是需要 同其它甜菜或者甜菜属的其它物种的植株进行异花授粉才能产生种子.如前面讨论的 那样,花药产生的花粉颗粒是圆形的,具有无数的凹陷,花药可以产生约17000粒花 粉颗.散布开来的花粉颗粒的生活力最多只有24个小时,其具体的长短取决于温度和 湿度等环境条件 (OECD, 2001). 受花粉调节的、从一个植物物种向另一个物种的基因渗入(如糖甜菜向另一个物 种的基因流动)只有在下列的条件被满足之后才会发生:1) 两个物种为有性融合;2) 两个物种花期相遇;3)两个物种种植地区相互靠近.在欧洲,目前已经测定了从甜菜 向甜菜属野生物种进行花粉调节的基因飘移特点(Desplanque et al., 1998) .由于存在地 理和农艺性状上的屏障,H7-1通过花粉的基因飘移不会产生抗农达农用除草剂的糖甜 菜近缘品种. 影响基因飘移的地理因素 众所周知,糖甜菜能同甜菜属的其它成员,包括野生亲缘种自由杂交(OECD, 2001).在美国,能和糖甜菜杂交的野生亲缘种不多,而能与之杂交的野生亲缘种之 中,B. vulgaris ssp. maratima 和B. macrocarpa 的群体生长在加利福尼亚州,有证据表 明B. macrocarpa 已经同甜菜栽培品种实现了杂交(Bartsch和Ellstrand, 1999).它们是美 国现在仅有的两种甜菜野生亲缘种,但它们只生长在加利福尼亚州.在旧金山地区存 在一个群体,但在该地区,没有甜菜种植.第二个群体,从植物分类学上讲,属于 Beta macrocarpa,是在帝王谷发现的,被认为是糖甜菜里的一种杂草.根据Panella 和Llewellyn博士的观点,在美国的耐受除草剂甜菜栽培种和B. macrocarpa 或者和其 它野生甜菜物种之间的基因流动而导致杂交植物造成杂草的问题是极不可能的.其根 据是B. macrocarpa的花期比甜菜早得多,没有明显的重叠,所以在田间它们在时间上 是相互绝缘的.此外,对温室里产生的F1代杂交种进行的评价证明,它们主要是雄性 不育,而随后的F2代杂交植株具有严重遗传率和生长习性障碍,这些特点都不会支持 自然界里杂交植株的存活. 还有如下的证据支持Panella 和Llewellyn博士的结论,即:通过二年生长习性的 甜菜传播有活力的花粉,大面积繁育糖甜菜种子,主要是在俄勒冈的Willamette河谷,在那里没有已知的野生甜菜物种.在俄勒冈,每年约有3000至5000英亩用来生产 种子.鉴于甜菜栽培品种的野生亲缘种只存在于加利福尼亚州,所以,在野生亲缘种 和糖甜菜栽培品种间,预期不会发生基因漂移. 减少基因飘移可能性的农艺因素 除了地理因素能影响基因流动之外,农艺因素也能影响甜菜的基因漂移的可能 性.在俄勒冈进行的甜菜种子的繁育过程中,按照能否遵守俄勒冈种子认证标准,选 定了签合同的种植者.这些标准要求在糖甜菜品种之间要最少有3200英尺(约1000 米)宽的隔离带,而同其它甜菜属物种,包括饲料甜菜、红甜菜和叶用甜菜,应至少 有8000英尺(约2400米)宽的隔离带.这样的隔离宽度必定会阻止花粉的(风/昆虫)传播,据报道,花粉的传播距离小于1000米)(Dark, 1971). 由于糖甜菜种植的目的是收获营养块根,所以,从遗传学角度来说,糖甜菜生产 中发生的花粉调节的基因漂移,其发生的可能性是较低的.在甜菜的生产过程中,可 孟山都公司申请书_H7-1 52 能出现一些环境条件,能诱发植株开花或者俗称"抽苔"的现象.在甜菜的生产中,由 于提前种植低春化要求的、抽苔敏感糖甜菜品种,随后又在植株早期发育阶段遇到寒 冷条件,通常就会发生抽苔现象.此外,在之前讨论到的在田间越冬的(甜菜或亲缘 植物),如果得不到控制的话,会在下个生长季抽苔.这些类型的抽苔植物能够散布 花粉,如果存在其中的一种,它就会争夺养分和水分,于是会影响根的产量.因此, 目前,采用农艺方法来控制抽苔植株. 另外种子生产者在向市场投放新品种之前,要进行编号试验,以满足工业要求和 田间表现标准.在更换抽苔敏感品种时,要进行标号试验,以选取抽苔特性较小的新 栽培品种.采用这种方法,最近培育出了对于抽苔更不敏感的品种.如果由于存在抽 苔敏感的品种或者田间越冬植株,在生产甜菜根的田块里出现了抽苔植株,即应进行 田间巡查并把它们人为地拔掉.这一农艺方法加上选用抗抽苔的新品种,能明显地减 少在糖甜菜根生产时花粉散落的可能性. 假如在抗农达甜菜H7-1转化体和其它甜菜属物种间偶然发生了花粉调节的基因漂 移,产生的杂交植株也仍然可以采用耕翻或者喷施含有其他效成分的除草剂进行防 治. 3.2.7 转变成杂草的可能性 根据田间试验结果,H7-1与非转基因之间在生殖方式和生殖率(花序和开花特 性)、传播方式和传播能力(花药、花粉特性及胚珠特性)、休眠期、适应性(形态 学和农艺性状比较)等生物学特性上没有明显差异(表6、7、8、9),因此H7-1转化 体不会影响甜菜的生存竞争能力. 在H7-1和非转基因对照的对比研究里,针对种子萌发特性、植株活力、产量等 农艺性状特性(3.2.4 表9)、表现型(3.2.3 表8)和花序、花药、花粉、胚珠的形态 学特性(3.2.1 表6,3.2.2 表7)进行了评估,评估它们的变化能否影响植物杂草潜 势.在这些特点的评估中,没有发现H7-1、对照、其他有代表性的常规品系任何具有 生物学意义的差异,鉴于其具有亲缘关系并且不能提高杂草潜势,评估的结果认为它 们实质上没有区别.这些数据表明,H7-1与非转基因对照和其它常规甜菜品系一样, 都不具有杂草化的倾向. 3.2.8 抗病虫转基因植物对靶标生物及非靶标生物的影响,包括对环境中有益和有害 生物的影响 转基因甜菜H7-1的目标性状是抗农达除草剂,而非抗病虫,因此不适用对靶标 和非靶标生物的影响评价.以下只是针草甘膦类除草剂如农达及CP4 EPSPS 蛋白的环 境安全性进行评估. 草甘膦除草剂 美国环境保护署续展决议(EPA RED)的生物学评估支持如下结论,即,同氟 乐灵相比,草甘膦的使用能减少鸟类的慢性毒性风险;同EPTC(见下面列表)相比,草甘膦的使用能减少小型哺乳动物的急性毒性风险.Select 2EC(烯草酮)的产 品标签,提出了其对于联邦政府列出的濒临灭绝植物物种的风险.在现有的资料里, 尚没有报道其它的除草剂产品和草甘膦对于鸟类和其非靶标陆生物种有任何巨大的风 险. 孟山都公司申请书_H7-1 53 对在甜菜生产中当前使用的其它除草剂有关曝露和危害信息的估计值进行分析 (表10),以得到当前风险商数定量性比较的结果.假设施给一英亩田地的喷施农药 的5%漂移至水中,和5%的径流从经处理的10英亩土地进入一英亩的六英尺深的池 塘,以此标准估测了各种产品的曝露率(以预期环境浓度(EEC)计算).按照产品 说明书指定的最大单次施用率,用除草剂进行了处理.关于各个有效成分的危害信息 (LC50 或EC50) 系来自于现有的EPA生态毒理学在线数据库,并且按照报道值域的上下 限做了总结.关于最终使用的制剂产品的危害信息,现在一般不易找到,所以,这个 分析仅仅针对活性成分.对于非靶标水生物种,在标签上对任何危害和/或其它风险 描述的提示也包括在内.通过用危害(LC50 或EC50) 值去除EEC,为每个活性成分测定 了风险商数. CP4 EPSPS蛋白 H7-1和其它抗农达作物产生的CP4 EPSPS蛋白质,类似于环境中植物和微生物 组织里广泛存在的天然CP4 EPSPS蛋白质.因此,根据这一事实可以推论转基因产生 的CP4 EPSPS蛋白质不会具有针对非害虫生物的生物学活性.尽管如此,一些研究人 员还是针对接触抗农达作物的各种节肢动物,进行了试验室调查(Goldstein, 2003; Boongird et al., 2003; Jamornman et al., 2003; Harvey et al., 2003).使有代表性的传粉 昆虫、土壤生物、有益节肢动物和害虫物种接触抗农达作物的组织(花粉、种子和叶 片).这些研究尽管设计各有不同,但结论却是一致的,即在接触了能产生CP4 EPSPS蛋白质的抗农达作物的各个物种里,都观察到CP4 EPSPS蛋白缺乏毒性 (Nahas et al., 2001; Dunfield and Germida 2003, Siciliano and Germida, 1999). 针对能产生CP4 EPSPS蛋白质的转基因大豆进行的田间试验,进一步证实了毒性 的缺乏.至于Collembola的多样性和丰富性,抗农达大豆和在同样的管理系统下生长 的常规大豆,并没有任何不同(Bitzer et al., 2000).针对在各种杂草管理系统下生 长的抗农达大豆进行的其它研究断定,这个抗农达特性对节肢动物没有明显的直接影 响,尽管同植物品种有关的杂草管理和表现型的差异(株高或成熟度)能影响节肢动 物的群体(Jasinski et al., 2003; McPherson et al., 2003; Buckelew et al., 2000).预计H7-1同样不能对节肢动物产生任何影响. 孟山都公司申请书_H7-1 54 表6 与其它可应用于甜菜的替代性除草剂比较-标识与暴露量 有效成分 产品品牌 标签警示 糖用甜菜 PHI(日) 最大有效成 分数量,磅/ 英亩(单施) 最大有效 成分数 量,磅/英亩(单季) 标签警告声明/特别指令/其它信息 施用人员和操作人员为减小 曝露风险而要求使用的个人 保护装备(PPE) 草甘膦 Glyphosate 农达 UltraMAX 小心 30 0.75 8 能引起中度眼睛红肿.请勿在钢瓶 储藏.目前证实存在四种抗草生物 型. 长袖衬衫、长裤、鞋和短袜 烯草酮a Clethodim Select 2 EC 或者 Prisim 警告 40 0.09 0.25 能引起实质性的、但暂时性的眼睛 损伤.吞入或者吸入有害.对皮肤 可能致敏.针对径流和飘散提出警 告.此产品的应用可能对联邦列出 的濒临灭绝的植物物种产生危害. 反复地使用会导致抗 性杂草生物型 的选育,对此提出警告.关于作物 会受到损伤的警告. 长袖衬衫、长裤、鞋和短 袜,防化手套、防护双目 镜.请勿重复使用严重污染 的衣物. 二氯吡啶酸 Clopyralid Stinger 小心 45 0.25 0.25 能造成眼睛的损伤.吸入或者通过 皮肤吸收对人体有害.在特定条件 下可漂洗进入地下水,对此提出警 告.1)使用处理过的植物材料或 者在经过处理的地区放牧动物所产 生的粪肥;2)撒施经处理的土 壤,都会造成作物的损伤,对此提 出警告由于作物存在受到损伤的风 险,许多作物的轮作限制期长达18 个月;建议进行田间生物分析. 长袖衬衫、长裤、鞋和短袜 孟山都公司申请书_H7-1 55 续表6 与其它可应用于甜菜的替代性除草剂比较-标识与暴露上的减轻 有效成分 产品品牌 标签警示 糖用甜菜 PHI(日) 最大有效成 分数量,磅/ 英亩(单施) 最大有效成 分数量,磅/ 英亩(单施) 标签警告声明/特别指令/其它信息 施用人员和操作人员为减小 曝露风险而要求使用的个人 保护装备(PPE) 环草敌 Cycloate Ro-neet 小心 NA;种植前掺 入44吸入有害.避免污染食品或饲料. 要求掺入土壤或者注入土壤.作物 受损伤的关注,依土壤类型的不同 而不同. 长袖衬衫、长裤、防化手 套、鞋和短袜.对于非封闭 系统来说,在加利福尼亚需 要增加个人保护装备;对于搅 拌人员/装卸人员:防化服、 全面式防毒面具;对于施用 人员:连衣裤工作服和半面 式防毒面具; 21日施用期的 用量极限为93加仑. 甜菜胺b Desmedipham Bethanex Betanex Caution小心75 1.2 1.92 吸入有害.能引起中度眼睛红肿. 皮肤接触的时间过长或者过频可能 引起变态反应.此产品里含有有毒 的惰性成分异佛尔酮.此产品对鱼 类有毒.请勿在可能发生径流的地 区使用.在许多情况下糖用甜菜可 能受到损伤. 长袖衬衫、长裤、防化手 套、鞋和短袜、防护双目 镜. 甜菜安/ 苯草敌 Desmedipham Bethnaex/Phen medipham Betamix 警告 75 1.2 1.92 能引起实质性的、但暂时性的眼睛 损伤.吞入或者通过皮肤吸收有 害.此产品里含有有毒的惰性成分 异佛尔酮.此产品对鱼类和水生物 有毒.飘散和径流等可能对鱼类和 水生物有害.物理性危险:可燃. 在许多情况下对糖用甜菜可能造成 损伤;建议在傍晚施用.谷物轮作 限制期为120天. 长袖衬衫、长裤、防化学手 套、鞋和短袜、防护双目 镜. 孟山都公司申请书_H7-1 56 续表 6. 与其他可应用于甜菜的替代性除草剂比较-标识与暴露上的减轻 有效成分 产品品牌 标签信号 词 糖用甜菜 PHI(日) 最大有效成 分数量,磅/ 英亩(单施) 最大有效 成分数 量,磅/英亩(单季) 标签警告声明/特别指令/其它信息 施用人员和操作人员为减小 曝露风险而要求使用的个人 保护装备(PPE) EPTCc Eptam 小心 NA;种植前掺 入或者出土 后早期掺入 4.2 5.6 吞入有害.避免吸入喷雾.要求掺 入或者注入土壤,除非通过灌溉施 用. 长袖衬衫、长裤、防化手 套、鞋和短袜. 乙氧呋草黄 Ethofumesate Nortron 小心 90 3.6 4 吞入、吸入或者通过皮肤吸收有 害.除了糖用甜菜或者黑麦草外, 作物的轮作限制期为6至12个月. 请勿用处理过的作物饲喂牲畜. 长袖衬衫、长裤、防水手 套、鞋和短袜. 杀草敏 Pyrazon Pyramix DF 小心 0 7.3 7.3 吞入、吸入或者通过皮肤吸收有 害.避免吸入粉尘或者喷雾.能造 成眼睛中度红肿.显著的作物损伤 的警告声明,严重程度取决于土壤 含水量、土壤类型(有机质含量、 壤土、砂质等)、施用温度、施用 方法和桶混产品. 长袖衬衫、长裤、防化手 套、鞋和短袜.请勿重复使 用被此产品浓缩液严重污染 的衣物. 孟山都公司申请书_H7-1 57 续表 6. 与其他可应用于甜菜的替代性除草剂比较-标识与暴露上的减轻 有效成分 产品品牌 标签信号 词 糖用甜菜 PHI(日) 最大有效成 分数量,磅/ 英亩(单施) 最大有效 成分数 量,磅/英亩(单季) 标签警告声明/特别指令/其它信息 施用人员和操作人员为减小 曝露风险而要求使用的个人 保护装备(PPE) 喹禾糖酯 Quizalofop-p- ethyl Assure II 危险 除了饲用顶 尖部分60天外,其它为 45天0.17 0.17 能造成眼睛严重红肿.可能造成皮 肤、鼻和咽喉红肿.通过皮肤吸 收、吞入或者吸入可能有害.此产 品内含有石油基馏出物.没有标明 的作物,其轮作限制期为120天. 需要添加喷施助剂. 长袖衬衫、长裤、防化手 套、鞋和短袜、防护双目 镜.请勿反复使用被此产品 浓缩液严重污染的衣物. 氟乐灵e Trifuralin Treflan HFP Caution小心NA;在第一个 真叶和6英寸 阶段之间施 用一次 0.72 4.0 能引起眼睛中度红肿,吸入有害, 潜在的紧肤致敏源.此产品内含有 芳香族碳氢化合物,如果吞入会极 为有毒.此杀虫剂对于淡水、海洋 和河口鱼类和水生无脊椎动物极有 毒.要求在施用24小时内掺入土 壤.作物损伤警告.作物轮作限制 期为5到21个月.被确认的多元抗 性杂草生物型. 长袖衬衫、长裤、鞋和短 袜、防化学手套、防护双目 镜.请勿重复使用被此产品 浓缩液严重污染的衣物. 稀禾啶d Sethosydim Poast 警告 60 0.40 0.8 能引起实质性的、但暂时性的眼睛 损伤.吞入有害.此产品对水生物 有毒.作物损伤警告.多元确认的 抗性杂草生物型. 短袖衬衫和短裤,外罩连衣 裤工作服,防化手套、防化 靴、防护双目镜、防化头盔 以防头部曝露、防化围裙, 以便进行清洁、混合、装卸 等工作. 氟胺磺隆 Triflusulfuron Upbeet 小心 60 0.008 0.08 抗性杂草生物型;多元MOA抗性.需要添加喷施助剂. 长袖衬衫、长裤、防化学手 套、鞋和短袜. CBI-Deleted 孟山都公司申请书_H7-1 58 表6说明 NA表示不适用. a 根据长期日粮曝露估计的烯草酮耐性 (67 FR 46893,最终规则,2002年7月17日)的百分比数据;按每个标签声明计算;对于濒临灭绝植物物种风险的关 注. b 1996年甜菜安RED:对搅拌人员和装卸人员皮肤曝露的曝露极限(MOE);对于施用人员吸入曝露可湿性粉剂的观察,要求每英亩施用量极限和每日 处理英亩数;对于鸟类有低到中度的长期风险. c 1999年EPTC RED;由于神经毒性作用,保留了10x FQPA UF;要求进行开发性的神经毒性研究;可逆的胆碱酯酶抑制因子;利用平均残留和百分作物 处理数据,为长期日粮评估,进行第3层提纯;对搅拌人员和装卸人员皮肤曝露和吸入曝露的关注;对于小型哺乳动物和非靶标植物风险的关注,包括 对濒临灭绝物种遭受径流和喷雾飘散风险的关注. d 根据当前稀禾啶耐性作用(66 FR 51587,最终规定,2001年10月10日),由于大鼠发育毒性研究中发现了胎儿效应,所以,aPAD包括了对13岁以上女 性的急性曝露的其它3x FQPA UF;预期能得到长期曝露评估所需要的残留和作物处理数据. e 1995年氟乐灵RED:对操作人员、装卸人员和田间工作人员癌症风险的关注;对鱼类和水生无脊椎动物有中度到高度毒性;由于在禽类研究中发现了 蛋破裂的证据,对于鸟类长期风险的关注. CBI-Deleted Deleted 孟山都公司申请书_H7-1 59 3.2.9 对生态环境的其他有益或有害作用 表10 中根据农药标签比较了草甘膦和其它除草剂的毒性和潜在影响.这些参数 表明了 H7-1 由于引入了抗农达性状,不仅提供了简便有效的田间杂草防除方式,而 且使用草甘膦较氟乐灵和烯草酮更安全.此外,由于草甘膦的淋溶和径流潜势较低 (L).用现有的信息进行比较,有七种除草剂证明具有中等(M)或高等(H)漂 洗潜在风险,它们是:二氧吡啶酸(clopyralid), 环草敌(cycloate), 甜菜胺 (desmedipham), EPTC, 乙氧呋草磺(ethofumesate), 杀草敏(pyrazon) 和 喹禾 糖脂(quizalofop).尽管目前尚没有信息可用来计算烯草酮(clethodim)的GUS 指数,但是其产品标签上确实已经对通过径流的水污染作了警示.可以断言,在抗农 达甜菜系统中,利用农达农用除草剂来防治杂草,能减少地下水和地表水的污染,. 孟山都公司申请书_H7-1 60 3.3 转基因植物与受体或亲本植物在对人类健康影响方面的差异 3.3.1 毒性 在甜菜的长期安全应用史里,至今尚未见到任何关于对人类或动物健康产生抗 营养或者其它不良效应的报道(OCED, 2002). a. CP4 EPSPS蛋白与已知蛋白或毒素生物信息学分析 利用FASTA序列分析软件为工具进行生物信息学分析(Pearson and Lipman, 1988),比较了CP4 EPSPS 蛋白与TOXIN5 和ALLPEPTIDES数据库里各种蛋白结构 的相似性,以保证该蛋白与有毒的或者具有潜在药理学活性的、已知能导致不良健 康效应的蛋白不同,不具有毒性或者药理学活性.(报告4) 将CP4 EPSPS蛋白的氨基酸序列与ALLPEPTIDES公共蛋白数据库进行检索比 较,该数据库包含了SwissProt(38+版)、TrEMBL(每两周更新一次)、GenPept (116版)数据库的所有公共蛋白序列,结果检索到144个重叠序列,但这些大量的 重叠序列均为不同物种来源的EPSPS蛋白,这在以前的研究中报道过(Harrison et al., 1996).第二类重叠序列是UDP-N-乙酰基葡萄糖转移酶类,已知这些酶和 EPSPS 蛋白具有一致的三维拓扑结构,催化肽聚糖生物合成的第一步(Garret and Grisham, 1999),肽聚糖是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成.此外 还检索到2个RNA聚合酶的а-链与CP4 EPSPS蛋白具有比较低的相似性,RNA聚合 酶催化原核生物和真核生物中DNA的转录.人类具有长期的对乙酰基葡萄糖转移酶 和RNA聚合酶及其活性的安全接触历史.除此之外在ALLPEPTIDES公共蛋白数据 库未检索到其他重叠序列. 同样是利用FASTA序列分析软件还分析了CP4 EPSPS蛋白与毒素数据库 (TOXIN5)里的各种蛋白的结构相似性,并根据相似性程度对这些蛋白进行了排 序.其中最具相似性的蛋白是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)神经磷脂酶C的先导 蛋白(登记号码P11889),二者有131个氨基酸重叠,重叠率只有28.2%(E-值为 0.26).该结果表明CP4 EPSPS蛋白与任何已知毒素蛋白不可能具有相似性. b. CP4 EPSPS蛋白的小鼠急性口服毒性 大肠杆菌纯化的CP4 EPSPS蛋白与抗农达甜菜H7-1表达的CP4 EPSPS蛋白在分子 量和免疫特性上的一致性通过Western Blot 进行了分析.(报告6) 把成熟的CP4 EPSPS蛋白按单一高剂量饲给小白鼠,以此评估其急性口服毒性 (Harrison 等, 1996).本研究的结果证明,成熟的CP4 EPSPS蛋白没有毒性.CP4 EPSPS蛋白系由大肠杆菌产生,并进行了纯化,此蛋白业已定性(Harrison 等, 1996) 并证明等同于转化体H7-1内的CP4 EPSPS蛋白,通过管饲法利用大肠杆菌纯化的蛋 白饲喂小白鼠以评估其急性毒性.鉴于有毒蛋白能通过急性机制起作用,所以,人 们认为,为了评估CP4 EPSPS蛋白的安全性,进行急性喂饲是十分恰当的(Sjoblad 等, 1992; Pariza和Foster, 1983; Jones 和Maryanski, 1991).小白鼠口服毒性的无作用剂 量(NOEL)是572 mg/kg,这是受试的最高剂量(Harrison 等, 1996).在媒介或牛血 清蛋白的蛋白对照组和CP4 EPSPS蛋白处理组之间,在体重、饲料消耗量、存活 率、临床观察或者总体病理学上,都没有统计学上的显著差异.鉴于绝大多数的蛋 白都是无毒性的(Pariza和Foster, 1983),已经证明CP4 EPSPS蛋白在胃肠液里极易进 孟山都公司申请书_H7-1 61 行离体消化(Harrison等, 1996),并且在膳食中已经存在具有安全食用史的、同样 的CP4 EPSPS蛋白,所以,这一结果是在意料之中.(报告5) c. CP4 EPSPS蛋白供体生物农杆菌CP4小种的安全性 农杆菌CP4小种(Agrobacterium sp. strain CP4)被选作供体生物是因为其能产 生天然的抗草甘膦EPSPS蛋白而使其表现为对草甘膦的抗性(Padgette et al., 1996).该细菌的分离物,即CP4,已经过采用美国微生物培养库(American Type Culture Collection)进行的分离鉴定,最终确定为属于农杆菌的生理小种.目前还没 有报道表明农杆菌中的任何种对人体或者动物具有致病能力,而且农杆菌一般不是 致敏源,没有必要做毒性试验(Finkelman et al., 1988; Hsieh et al., 1993).此外,根据 FAO/WHO(2001)报告,目前还不知道有任何的人群对该细菌性蛋白敏感. 农杆菌CP4小种来源的EPSPS蛋白与其他耐草甘膦的EPSPS蛋白相比,对草甘 膦耐受性更高(Barry et al., 1992; Padgette et al., 1996).EPSPS是植物中(包括甜菜) 和微生物芳香族氨基酸生物合成过程中,莽草酸途径的催化酶(Levin and Sprinson, 1964; Steinrücken and Amrhein, 1980),因此这个酶及其活性在植物来源制品中早已 存在.多种EPSPS蛋白表达基因早已被克隆(Padgette et al., 1996),细菌EPSPS蛋白 也已通过三维X-射线晶体结构(Stallings et al., 1991)和详细的动能和化学机理 (Anderson and Johnson, 1990)进行了定性.CP4 EPSPS只是自然界中发现的不同种 EPSPS的一个代表,与EPSPS酶除了与草甘膦的亲和性以外,功能上是一致的. 供体生物的安全性在孟山都公司以前提交的许多产品申请时已经经过了严格的 审查,并被认为是安全的,并且这些产品都获得了批准,这包括抗农达大豆40-3- 2(1994)、抗农达油菜(1995)、抗农达棉花1445(1995)、抗农达玉米NK603 (2000)和抗农达甜菜(1998). d. CP4 EPSPS与来源于食品的、具有长期安全消费史的各种EPSPS的相似性 在H7-1里表达的CP4 EPSPS蛋白类似于已经广泛存在于各种食品和饲料的各种 EPSPS蛋白.如表11所示,CP4 EPSPS蛋白和天然存在于植物里的各种EPSPS具有同 源性,包括粮食作物(如大豆和玉米)、真菌和微生物来源的食品(如酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)食品),而这些作物和食品都具有人类长期安全消费的 历史(Padgette et al., 1996; Harrison et al., 1996).鉴于CP4 EPSPS蛋白与在各种食 品中的EPSPS的相似性,使人们有理由大量地消费CP4 EPSPS蛋白家族,而不必害 怕它有损人体健康.此外,同源EPSPS酶在粮食作物和普通微生物里是无所不在 的,这证明CP4 EPSPS蛋白以及它们的酶活性不会对人体和动物的消费造成危险. 表11. 天然CP4 EPSPS推导氨基酸序列同其它EPSPS进行比较 CP4 EPSPS 大豆 玉米 矮牵牛 大肠杆菌 枯草杆菌 酿酒酵母 %相同序列 %序列相似性 26 51 24 49 23 50 26 52 41 59 30 54 孟山都公司申请书_H7-1 62 e. CP4 EPSPS蛋白在商用粮食和饲料作物里的存在 自从1996年投放市场以来,含有CP4 EPSPS的作物已经广泛种植并作为食品和 饲料消费.孟山都开发的第一代抗农达转基因大豆40-3-2就是其中很重要的一个含 有CP4 EPSPS蛋白的作物.到2005年,它在美国大豆产区已占全部大豆面积的 89%.从全球来看,抗农达大豆(40-3-2)种植面积达到约1.34亿英亩,占全球大豆 种植面积的57%(James, 2006).根据推算,全球消费的大豆和大豆产品中有60% 可能含有CP4 EPSPS蛋白. 除了大豆,其它主要用作粮食和饲料的抗农达作物也都表达CP4 EPSPS蛋白, 包括抗农达的玉米、油菜、糖用甜菜、苜蓿和少量的抗农达棉花.在2005年,这些 抗农达转基因作物,包括单一性状和复合性状,在全球的种植面积已经超过了6990 万公顷(James, 2006).总之,全球有1/4的食品和饲料中可能含有CP4 EPSPS. 如上所述,人们从1996年起即开始消费含有CP4 EPSPS的食品和饲料产品了.目前 还没有任何证据表明含有CP4 EPSPS的食品或饲料对人或动物有任何不良影响.所以,有理由认为H7-1甜菜以及含有CP4 EPSPS蛋白的食品和饲料是安全的. f. H7-1动物喂养试验 孟山都公司将含有转化体H7-1的糖用甜菜加工甜菜浆(pulp)饲喂大鼠,同时 对照组饲给具有能代表试材的遗传学背景、但缺乏抗农达特性的常规对照饲料,连续13周喂养后,评价H7-1的食用安全性.(报告7) 抗农达糖用甜菜转化体H7-1品种11257加工甜菜浆(以下称为试验品种)分别 按日粮浓度2%和5%(w/w)饲给Sprague-Dawley雌雄大鼠组.常规对照,即11259 品种加工成甜菜浆(以下称为对照品种),按大约5%(w/w)的比例配制成日粮, 按相同的方法饲给大鼠,为期至少90天.每组由20只雄鼠和20只雌鼠组成.每天二 次观察全部大鼠的死亡率和垂死率.每天进行临床检查,每周进行详细的体检.每 周记录个体体重和饲料消耗率.按计划的尸体剖检时间(研究第13周)首先以每组 雌雄各10只进行临床病理学评估(血液学、血清化学和尿液分析).全部的大鼠进 行全面的尸体剖检,选定的器官按计划的尸体剖检时间进行称重.对来自于饲给含 有对照品种和5%试验品种的日粮的全部大鼠的、选定的组织,用显微镜进行了检 查. 全部的大鼠都存活到了计划尸体剖检的时间,没有观察到与测试品相关的不良 临床结果.试材的饲给没有影响体重、血清化学和尿分析参数;测试品的饲给没有 影响饲料消耗率、血液学参数或器官重量;饲给试验品种11572的大鼠的反应居于饲 给含来自于糖用甜菜浆基准对照品种的糖用甜菜浆的大鼠组的反应范围之内.在宏 观或微观检验组织过程中,没有发现与测试品相关的不良结果.可以得出结论:抗 农达糖用甜菜转化体H7-1糖用甜菜浆,对于大鼠的生长、健康或者行为特性,没有 产生不良效应. 根据中国农业部的要求,孟山都公司提供H7-1以及相应的非转基因对照脱水甜 菜浆,中国疾病控制与预防中心对此进行了大鼠90天喂养的验证性实验(报告8、报告12).试验选用140只断乳Wistar大鼠,按体重随机分成7组,每组20只(雌雄各 半).7个试验组分别饲喂常规饲料、含有3个剂量非转基因对照甜菜浆的饲料 (2.5%、5%和10%)和含有3个剂量转基因H7-1甜菜浆的饲料(2.5%、5%和10%).结果表明,转基因甜菜浆H7-1掺入饲料饲喂大鼠90天,动物活动、生长未 见异常,被毛有光泽.转未发现转基因甜菜将H7-1对大鼠体重、食物利用率、血液 孟山都公司申请书_H7-1 63 学指标、脏器重量、脏器比以及组织病理学观察有生物学意义的改变. 3.3.2 过敏性 评价蛋白的致敏性通常要将其与已知的致敏蛋白的生物化学特性进行比较.如 果某种蛋白具有下列特点,那么它就不可能是致敏蛋白: 1. 该蛋白来源于非致敏蛋白源; 2. 该蛋白在整个蛋白中所占比例不大; 3. 在氨氨酸序列方面,该蛋白同已知的致敏原没有结构的相似性; 4. 该蛋白在模拟胃液的消化系统中表现不稳定. a. CP4 EPSPS蛋白的来源 如前所述,cp4 epsps编码序列来自于一个天然存在的土壤细菌,利用美国微生 物培养库(American Type Culture Collection)进行的分离鉴定,已经证实该土壤细 菌为根癌瘤农杆菌的CP4小种.由于目前没有关于研究报告表明根瘤农杆菌属于致 敏源,因此,可以确定CP4 EPSPS蛋白不是来源于一个已知的致敏源.此外,根据 FAO/WHO(2001),目前还不知道有任何的人群对细菌蛋白过敏. b. CP4 EPSPS蛋白在全部蛋白中所占比例 1998-1999 年在欧洲的试验中的数据表明,在转化体 H7-1 根系内的 CP4 EPSPS 蛋白水平按鲜重计算,居于 145 至202?g/g 之间(表3,报告 2).而另一研究,关 于转化体 H7-1 根系组成的数据表明,其平均含水量为 74.54%,其平均蛋白总量, 按干重计算,为5.51%(3.3.4 表13).利用 CP4 EPSPS 蛋白最高鲜重水平 202 ?g/g 计算,CP4 EPSPS 蛋白将占转化体 H7-1 里的蛋白干重总量的 1.44%1 ;由此可见在 来自于转化体 H7-1 根的、含有蛋白的食物里,CP4 EPSPS 蛋白只能在蛋白总量里占 很小的份额. c. CP4 EPSPS蛋白同已知致敏源序列同源性的生物信息学分析 利用FASTA序列分析软件为工具进行生物信息学分析(Pearson and Lipman, 1988),比较了CP4 EPSPS 蛋白与AD4过敏原数据库里各种蛋白结构的相似性,以 评价该蛋白是不是过敏原,并且与已知过敏原是否有交叉反应(报告4),并依据 CP4 EPSPS 蛋白与过敏原蛋白的相似性进行了排序.其中相似程度最高的为尘螨 (Dermatophagoidesfarinae)过敏原Der f 2(登记号AAB330829),其中在1个82 个氨基酸长度的片段上其同源性为30.5%,F值为0.41.如果在CP4 EPSPS全长序列 (455个氨基酸)上进行比较,重叠的序列相对很少(18%).因此可以推测CP4 EPSPS 蛋白和 Der f 2过敏原没有结构和功能上的同源性.由于氨基酸一致性序列至 少超过整个蛋白质全长的50%以上时才可能存在过敏交叉反应 (Aalberse, 2000),因此CP4 EPSPS蛋白和Der f 2过敏原极不可能存在交叉反应.其余的比较分析结果表 明,CP4 EPSPS蛋白和其它致敏源之间没有显著的相似性. d. CP4 EPSPS蛋白在模拟消化液中的稳定性分析 1 202 ?g/g CP4 EPSPS鲜重 ? (1 – 74.54% 含水量/100) = 793 ?g/g CP4 EPSPS 干重 = 0.0793% CP4 EPSPS 干重; 0.0793% CP4 EPSPS 干重 X 100%/5.51%蛋白总量 = 蛋白总量里CP4 EPSPS的1.44%. 孟山都公司申请书_H7-1 64 Harrison等人(1996)证明了CP4 EPSPS蛋白能在模拟胃液里迅速降解.根据 蛋白质印迹杂交分析,CP4 EPSPS在胃消化系统的半衰期不到15秒钟,在肠消化系 统里不到10分钟.因此,即使任何的CP4 EPSPS蛋白可以坚持进入胃消化系统中的 话,也势必会迅速降解掉. 随后进行的CP4 EPSPS蛋白离体模拟胃液(SGF)消化试验也证实了上述观点 (报告9),该试验采用国际生命科学研究所(ILSI)公布的标准方法(Thomas et al., 2004).同Harrison等人(1996)以前的试验一样,本项研究也采用了大肠杆菌 生产的CP4 EPSPS蛋白,消化率采用SDS-PAGE凝胶染色(colloidal blue staining)、 蛋白质印迹杂交(Western blot)和CP4 EPSPS酶活性鉴定进行评估. 试验结果证实了大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白SGF里迅速被消化.SDS- PAGE凝胶染色结果表明,98%以上的CP4 EPSPS蛋白在15秒钟内被消化(图13). Western杂交分析结果表明,CP4 EPSPS蛋白有95%在15秒钟内被消化(图14).同样,CP4 EPSPS蛋白在SGF里培养不到15秒钟,其活性降低到了10%以下(表12). 总之,可以断定大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白能在模拟胃液里迅速降解,所以不 可能对人体健康产生危险. 表12. 在模拟胃液消化后大肠杆菌生产的CP4 EPSPS蛋白的比活性 样本 比活性 (单位/mg蛋白) 无胃蛋白酶的试验对照培养0秒钟 4.92 无胃蛋白酶的试验对照培养60分钟 2.10 大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白在SGF里培养0秒钟 5.63 E.大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白在SGF里培养15秒钟 0.27 E.大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白在SGF里培养30秒钟 0.15 E.大肠杆菌产生的有CP4 EPSPS蛋白在SGF里培养60秒钟 0.15 无CP4 EPSPS的试验对照培养0秒钟 0.02 无CP4 EPSPS的试验对照培养60分钟 0.05 缓冲液空白 0.01 65 图13. SDS-PAGE凝胶染色结果,显示纯化的大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白 在模拟胃液里的消化情况 采用10?20%聚丙烯酰胺梯度凝胶(SDS-PAGE)分离蛋白,缓冲液为tricine缓冲液,亮蓝G染色.大肠杆菌 产生的CP4 EPSPS蛋白,根据消化前的浓度,按每泳道500ng加样. 泳道 描述 培养时间 1 分子量标记 2 无胃蛋白酶的试验对照(P0) 0 秒3无CP4 EPSPS的试验对照 (N0) 0秒4在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 0 0秒5在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 1 15秒6在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 2 30秒7在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 3 1 分8在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 4 2分9在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 5 4分10 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 6 8分11 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 7 15分12 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 8 30分13 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 9 60分14 无CP4 EPSPS的试验对照(N9) 60分15 无胃蛋白酶的试验对照(P9) 60分 孟山都公司申请书_H7-1 66 图14. 蛋白质印迹杂交分析结果,显示纯化的大肠杆菌产生的 CP4 EPSPS蛋白在模拟胃液里的消化 采用10?20%聚丙烯酰胺梯度凝胶(SDS-PAGE)分离蛋白.大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白,按90%的纯度并 根据消化前的浓度,按每泳道1ng加样. 泳道 描述 培养时间 1 分子量标记 2 无胃蛋白酶的试验对照 (P0) 0 s 3 无CP4 EPSPS的试验对照 (N0) 0 s 4 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 0 0 s 5 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 1 15 s 6 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 2 30 s 7 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 3 1 min 8 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 4 2 min 9 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 5 4 min 10 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 6 8 min 11 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 7 15 min 12 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 8 30 min 13 在SGF里的CP4 EPSPS蛋白, T = 9 60 min 14 无CP4 EPSPS的试验对照(N9) 60 min 15 无胃蛋白酶的试验对照(P9) 60 min 孟山都公司申请书_H7-1 67 3.3.3 抗营养因子 在甜菜的长期安全应用史里,至今尚未见到任何关于对人类或动物健康产生抗 营养或者其它不良效应的报道(OCED, 2002).(报告11). 皂角苷是天然存在于大豆、豌豆、马铃薯、茶叶和糖用甜菜等众多粮食和饲 料作物里的三萜系苷(Oakenfull和Sidhu, 1989).世界经合组织关于甜菜新品种营养 和抗营养成分的一致性文件(OECD, 2002)并未将皂角苷视为抗营养因子,也没 有将其视为在评价甜菜品种的营养一致性时需要考虑的化学成分.甜菜榨糖副产品 会由于皂角苷的存在引起反刍动物拒食,因此文献中将皂角苷看作拒食素,但迄今 没有皂角苷对人类和动物不良影响的报道.孟山都公司和KWS公司在对抗农达甜 菜H7-1进行食用安全性评价时将皂角苷作为抗营养成分进行了分析. 甜菜中的皂角苷最初是以齐墩果酸(Oleanolic acid)配糖的形式在叶片和根组 织中被发现的,齐墩果酸(Oleanolic acid)是甜菜皂角苷最普遍的糖苷配基,因此 甜菜中皂角苷的含量测定是通过HPCL法分析齐墩果酸的含量进行的.甜菜根齐墩 果酸含量的文献值域为75-965mg/kg鲜重(Lüdecke et.al, 1958). 由农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)对H7-1 和对照干甜菜 浆中齐墩果酸的含量进行了检测,结果分别为148mg/kg干重和121mg/kg干重,折合 为鲜重不会超过上述文献值域,说明抗农达甜菜与其亲本对照抗营养因子含量不会 有营养学和生物学意义上的不利影响,检测报告见报告16. 来自于转化体H7-1、对照和商用参照品种的根和顶尖样本,采用HPLC法进行 皂角苷分析(Ridout 等人, 1994; Schiweck 等人, 1991).表15 列出了数据小结. 表15 转化体H7-1叶和根组织皂角苷分析小结 对照样本1 受试转化体H7-11 参照品种2 文献 分析4 单位 平均值 值域 平均值 值域 平均值 值域 值域3 叶mg/kg 鲜重 65 47-100 58 34-93 76 27-200 50-600 根mg/kg 鲜重 90 54-120 92 54-150 99 63-170 75-965 注:对照样本 =具有同转化体H7-1相似遗传背景的非转基因对照. 1 n =5个试验点,重复样本的单个分析. 2 n = 5个试验点,重复样本的单个分析,八个商用品种. 3 参见参考资料Lüdecke 等人, 1958. 4 采用HPLC法进行皂角苷测定. 这些结果表明,转化体H7-1的皂角苷水平和非转基因对照观察到的水平及商用 参照品种表达的水平都没有差异.转化体H7-1里皂角苷的表达水平也落于常规品种 的公开文献的值域内.可以断定,转化体H7-1在皂角苷的水平上,同其它现有商用 糖甜菜品种并无不同. 由农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)采用HPLC法,对H7- 1和亲本对照干甜菜浆中齐墩果酸的含量进行了测定,结果表明二者之间没有生物学 意义上的显著差异. 孟山都公司申请书_H7-1 68 3.3.4 营养成分 利用加工成人类食品或者可以用作动物饲料的甜菜的组织,针对甜菜的重要营 养元素和成分,进行了组成分析.转化体H7-1同对照材料以及同商用甜菜品种进行 了比较.1999年,在欧洲重要的甜菜生产地区的五个试验点,进行了田间试验.田 间生产试验点位于法国、德国、意大利、西班牙和英国.在生长季节里,转化体H7 -1甜菜采用农达农用除草剂进行了处理.从转化体H7-1、非表达分离体对照和种 植在同试验小区位置的八个不同的甜菜品种上,采集了甜菜的顶尖(叶)和根组 织.在分析之前,把来自于各个甜菜样本的根组织加工成brei.重要的营养元素和 成分的含量水平分析详见报告10. 组成成分分析包括近似物值、碳水化合物、质量参数、皂角苷和十八种氨基 酸.通过分析,测定了顶尖(叶)和根(brei)样本的近似物值,包括粗灰分、粗 纤维、粗脂肪、粗蛋白和干物质.通过计算,确定了碳水化合物的数量.利用根样 本测定的质量参数,包括旋光度(蔗糖百分率)、转化糖、钠、钾和α-氨基氮..通 过分别分析各个小区的重复样本,测定了各个组成元素的报告平均值.采用为制糖 业规定的现有分析方法,在法国的二家合作试验室,AGREN和CERBIA-IRIS,进行 了组成分析. 转化体H7-1的组成数据值同非转基因分离体对照系进行了对比,这些对照系 的遗传背景类似于转化体H7-1的杂交种以及在同一田间试验里种植的现有商用品 种.对全部五个试验点的组合平均值进行了统计学分析,以识别转化体H7-1与其 非转基因对照在p<0.05水平上是否具有统计学显著差异.在表15到表21里报道了转 化体H7-1和对照系的组成分析结果,同时分析商用品种的组合试验点平均值和值 域,并提供了现有的文献值,供作比较.转化体H7-1营养价值经测定,发现等同 于非转基因分离体对照,并且居于商用甜菜品种的观察值域内. 近似物和碳水化合物分析:利用现有的标准方法进行了近似分析,包括甜菜顶 尖(叶)和根(brei)里的干物质、粗蛋白、粗纤维、粗灰分和粗脂肪等.总的来 讲,同非转基因对照样本相比,转化体H7-1的顶尖和根组织里,在平均近似值之间 没有统计学显著差异,顶尖组织的干物质的平均水平(表16和表17)是例外.然而,在转化体H7-1的叶片样本里测到的干物质平均水平和值域,的确显著地重叠了 非转基因对照、商用参照品种的值域和商用甜菜品种现有公布值. 此外,通过计算和进行统计学比较,确定了转化体H7-1和对照系顶尖和根组织 里可溶性碳水化合物的含量水平.在同非转基因对照比较时,转化体H7-1的地上部 叶片和根样本里的可溶性碳水化合物的含量水平没有统计学显著差异.表17里列出 这些数据. 孟山都公司申请书_H7-1 69 表16. 转化体H7-1叶片组织近似物分析小结 对照样本1 转化体H7-11 参照品种2 文献 分析 单位 平均值 值域 平均值 值域 平均值 值域 值域3 干物质4 % 16.37 13.69-19.83 17.98* 13.94-21.23 16.18 11.37-26.81 16-20 粗蛋白5 % DM 16.02 14.46-19.80 15.27 11.16-18.31 16.65 12.75-24.47 8.4-23.2 r粗纤维6 % DM 11.43 9.23-16.82 11.50 8.56-15.99 11.62 7.84-19.71 5.9-15.9 粗灰分7 % DM 19.50 15.39-21.96 21.95 17.84-31.90 21.80 16.20-27.91 11.5-34.4 粗 脂肪8 % DM 0.87 0.74-1.15 0.95 0.85-1.09 1.02 0.53-1.46 0-4.7 注:对照样本 =具有同转化体H7-1相似遗传背景的非转基因对照. 1 n =5个试验点,重复样本的单个分析. 2 n = 5个试验点,重复样本的单个分析,八个商用品种. 3 参见参考资料DLG1991. 4 采用烘干法测定干物质. 5 采用Kjeldahl法测定粗蛋白. 6 采用Weende法测定粗纤维. 7 采用烘干法测定粗灰分. 8 采用Soxhlet法测定粗脂肪. * 表示当和相应的非转基因对照比较时,在5%的水平上具有显著差异. 表17 转化体H7-1根(brei)组织物近似分析小结 对照样本1 受试转化体H7-11 参照品种2 文献 分析 单位 平均值 值域 平均值 值域 平均值 值域 值域3 干物质4 % 24.01 21.75-25.83 25.46 22.87-28.88 22.74 19.05-26.33 23 粗蛋白5 % DM 5.62 4.13-6.98 5.51 4.50-6.57 5.06 3.72-6.93 1.2-12.4 粗纤维6 % DM 4.84 4.57-5.04 4.54 3.73-5.20 4.75 3.65-5.69 3.4-7.4 粗 灰分7 % DM 2.54 1.78-3.21 2.51 1.73-3.35 2.41 1.74-3.89 1.3-17.7 粗脂肪8 % DM 0.20 0.06-0.38 0.13 0.08-0.18 0.16 0.05-0.25 0-1.8 注:对照样本 =具有同转化体H7-1相似遗传背景的非转基因对照. 1 n =5个试验点,重复样本的单个分析. 2 n = 5个试验点,重复样本的单个分析,八个商用品种. 3 参见参考资料DLG1991. 4 采用烘干法测定干物质. 5 采用Kjeldahl法测定粗蛋白. 6 采用Weende法测定粗纤维. 7 采用烘干法测定粗灰分. 8 采用Soxhlet法测定粗脂肪. 孟山都公司申请书_H7-1 70 表18 转化体H7-1的可溶性碳水化合物含量测定小结 对照2 供试转化体H7-12 参照品种3 文献 分析1 单位 平均值 值域 平均值 值域 平均值 值域 值域4 地上部 % DM 52.18 45.50-58.03 50.35 44.60-54.68 48.92 43.30-56.52 38.3-64.5 根%DM 86.80 84.44-89.02 87.31 85.58-89.04 87.62 83.31-90.05 67.3-90.9 注:对照 =具有同转化体H7-1相似遗传背景的非转基因对照. 1 碳水化合物计算=100%-(粗蛋白+粗灰分+粗纤维+组脂肪) 2 n =5个试验点,重复样本的单个分析. 3 n = 5个试验点,重复样本的单个分析,八个商用品种. 4 参见参考资料DLG1991. 营养品质分析:采用制糖业的现有方法,针对糖含量(按旋光度进行测定)、 转化糖(葡萄糖+果糖)、钠、钾和α-氨基氮,进行了brei 样本的品质分析.转化体 H7-1、非转基因对照和商用参照品种的根样品的品质分析结果列于表19.转化体 H7-1的五个测定成分的平均水平,同非转基因对照的相应平均值没有显著的差异. 表19 转化体H7-1根(brei)组织品质分析小结 对照样本1 受试转化体H7-11 参照品种2 文献 分析 单位 平均值值域 平均值 值域 平均值 值域 值域3 旋光度4 g/100g FW 18.12 16.11- 19.23 18.54 16.14-20.21 17.08 14.14-19.51 10.8-20.7 钾5 mmol/100g FW 3.85 3.08-4.87 3.85 3.08-5.13 4.10 2.82-5.38 2.95-10.21 钠6 mmol/100g FW 0.65 0.26-1.83 0.57 0.16-2.04 0.61 0.19-2.39 0.13-5.48 Ir转化糖7 mmol/100g FW 0.83 0.24-2.94 0.78 0.24-2.61 0.67 0.17-2.94 0.3-2.7 氨基-N8 mmol/100g FW 1.29 0.79-1.71 1.29 0.86-1.93 1.21 0.63-2.50 0.80-5.62 注:对照样本 =具有同转化体H7-1相似遗传背景的非转基因对照. 1 n =5个试验点,重复样本的单个分析. 2 n = 5个试验点,重复样本的单个分析,八个商用品种. 3 参见参考资料M?rl?nder 等人, 1996和Smed 等人, 1996. 4 采用旋光仪测定旋光度. 5 采用分光光度计测定钾. 6 采用分光光度计测定钠. 7 采用Berlin协会的方法测定转化糖. 8 采用分光光度计测定氨基-N. 氨基酸分析:表20 和表21分别列出了糖甜菜顶尖和根样本内氨基酸的水平.转 化体H7-1的地上叶片样品中测定的18种氨基酸里有14种的平均水平和非转基因叶片 样品没有显著的差异(表20).转化体H7-1中另外四种氨基酸(丙氨酸、组氨酸、 苯丙氨酸、酪氨酸)观察到的平均水平同非转基因对照的相应平均值相比,具有显 著差异.但是,转化体H7-1的这四种氨基酸所观察到的值域,显著地重叠或者完全 孟山都公司申请书_H7-1 71 落在非转基因对照和商用参照品种的观察值域内.因此,这些微小的差异看来不会 具有生物学意义. 转化体H7-1根样本里测定的18种氨基酸中的16种,其平均水平同非转基因对 照根样本里的同样氨基酸的平均水平,没有显著差异(表21).但是,转化体H7- 1根样本里测定的二种氨基酸(丙氨酸和谷氨酸)的平均水平同非转基因对照根样本 里同样的氨基酸平均水平,具有统计学差异.在转化体H7-1里的这二种氨基酸的 值域显著重叠或者完全落在了非转基因对照和商用参照品种的观察值域范围内. 表20 转化体H7-1地上部叶片组织氨基酸分析小结 对照样本2 受试转化体H7-12 参照品种3 分析1 单位 平均值 值域 平均值 值域 平均值 值域 丙氨酸 % 总量 aa 6.44 6.29-6.61 6.67* 6.29-7.07 6.53 5.98-6.97 精氨酸 % 总量 aa 5.36 5.13-5.69 5.44 5.06-5.91 5.42 4.68-5.96 天门冬氨酸 % 总量 aa 10.29 10.16-10.36 10.53 9.96-11.37 10.55 9.55-11.40 胱氨酸 % 总量 aa 1.73 1.18-2.24 1.90 0.87-3.20 1.77 1.07-3.05 谷氨酸 % 总量 aa 13.46 12.20-14.78 13.10 12.35-13.56 13.92 12.29-15.55 甘氨酸 % 总量 aa 6.86 6.23-7.32 6.80 6.45-7.47 6.78 6.21-7.80 组氨酸 % 总量 aa 2.46 2.00-2.73 2.29* 1.73-2.54 2.26 1.75-2.68 异亮氨酸 % 总量 aa 4.49 4.26-4.86 4.39 4.12-4.67 4.44 4.11-4.97 亮氨酸 % 总量 aa 8.20 7.58-9.19 8.13 7.66-9.06 8.01 7.16-9.01 赖氨酸 % 总量 aa 5.36 4.82-5.81 5.25 3.75-5.81 5.35 4.60-5.85 蛋氨酸 % 总量 aa 1.83 1.37-2.45 2.20 1.13-4.05 1.74 1.06-3.18 苯丙氨酸 % 总量 aa 5.12 4.76-5.46 4.98* 4.65-5.30 4.99 4.47-5.40 脯氨酸 % 总量 aa 7.04 5.53-7.95 7.04 6.55-7.47 7.15 5.46-9.58 丝氨酸 % 总量 aa 5.80 5.48-6.24 5.94 5.47-6.33 5.78 5.34-6.21 苏氨酸 % 总量 aa 4.82 4.42-5.05 4.71 4.09-5.07 4.47 3.39-5.23 色氨酸 % 总量 aa 1.60 1.30-1.86 1.69 1.17-2.13 1.81 1.37-2.45 酪氨酸 % 总量 aa 3.65 3.28-3.87 3.46* 3.05-3.69 3.63 3.21-4.70 缬氨酸 % 总量 aa 5.51 5.29-6.17 5.49 5.26-5.99 5.37 4.97-6.17 注:1 采用HPLC法测定氨基酸. 2 n =5个试验点,重复样本的单个分析. 3 n = 5个试验点,重复样本的单个分析,八个商用品种. * 表示当和相应的非转基因对照比较时,在5%的水平上具有显著差异. 孟山都公司申请书_H7-1 72 表21 转化体H7-1根(brei)组织氨基酸分析小结 对照样本2 受试转化体H7-12 参照品种3 分析1 单位 平均值 值域 平均值 值域 平均值 值域 丙氨酸 %总量 aa 5.29 4.69-6.33 5.91* 5.04-6.73 6.27 4.73-9.43 精氨酸 %总量aa 4.91 4.50-5.18 5.30 4.94-5.63 4.80 4.02-5.74 天门冬氨酸 %总量 aa 13.35 12.32-14.75 13.21 12.66-14.46 13.19 11.57-15.53 胱氨酸 %总量 aa 1.38 1.28-1.53 1.42 1.25-1.72 1.45 0.84-2.28 谷氨酸 %总量aa 18.58 15.66-21.85 16.87* 14.72-19.98 19.21 13.76-25.07 甘氨酸 %总量aa 4.23 3.74-4.54 4.73 4.15-5.21 4.61 3.83-6.18 组氨酸 %总量 aa 2.69 1.58-3.33 2.95 2.00-3.45 2.87 1.78-3.43 异亮氨酸 %总量aa 4.01 3.90-4.24 4.23 4.15-4.35 3.95 3.27-4.95 亮氨酸 %l总量 aa 6.09 5.55-6.61 6.47 5.90-7.18 6.07 4.82-6.95 赖氨酸 %总量 aa 5.42 3.50-6.88 5.73 4.29-6.52 5.49 3.69-7.11 蛋氨酸 %总量 aa 1.35 1.23-1.46 1.29 1.05-1.57 1.28 0.70-2.04 苯丙氨酸 %总量 aa 3.36 2.98-3.69 3.45 3.29-3.66 3.26 2.75-3.75 脯氨酸 %总量 aa 5.94 5.53-6.46 5.39 3.29-7.02 5.11 1.71-9.29 丝氨酸 %总量 aa 7.34 6.61-8.49 7.55 6.86-8.45 7.58 6.63-8.72 苏氨酸 %总量 aa 4.76 4.11-5.30 4.98 4.51-5.28 4.75 3.96-5.51 色氨酸 %总量aa 2.30 1.11-4.26 1.82 1.06-2.44 1.93 1.02-5.40 酪氨酸 % l总量 aa 3.53 3.27-3.86 3.55 3.09-4.23 3.34 2.51-4.23 缬氨酸 %总量 aa 5.47 5.10-5.82 5.14 3.79-5.87 4.84 1.99-7.49 注:对照样本 =具有同转化体H7-1相似遗传背景的非转基因对照. 1 采用HPLC法测定氨基酸. 2 n =5个试验点,重复样本的单个分析. 3 n = 5个试验点,重复样本的单个分析,八个商用品种. * 表示当和相应的非转基因对照比较时,在5%的水平上具有显著差异. 结论:进行了一系列的营养成份组成和品质成分的综合分析,把转化体H7-1的 营养成分同非转基因对照及各种商用糖甜菜参照品种的营养成分进行了比较.这些 分析包括: ? 顶尖和根组织近似物值的五个组分(干物质、粗蛋白、粗纤维、粗灰分和粗 脂肪)及碳水化合物的计算; ? brei(根组织)的五个营养品质指标分析; ? 在顶尖和根组织里18种氨基酸的含量; ? 在顶尖和根组织里的皂角苷含量分析. 对于转化体H7-1和非转基因、分离体对照系,针对顶尖(叶)和根(brei)组织,共进行了55项统计学对比,发现其中七项对比在p<0.05水平上具有统计学差 异.在这七项发现具有统计学差异的对比里,5%或者约为三项(0.05 X 55)是仅靠 机遇产生的假阳性.但是,在全部七项实例里,转化体H7-1里具有统计学差异的组 分的值域,显著地重叠或者完全落在了非转基因对照、商用参照品种的观察值域里 和商用甜菜品种现有公开的值域里.此外,观察值看来可能受到一些包括根成熟 度、采收日期、植物和土壤肥力和天气等环境因素的影响(Smed 等, 1996). 孟山都公司申请书_H7-1 73 这些结果证明,转化体H7-1关键营养元素和其它重要营养成分的水平,等同于 非转基因对照和其它商用甜菜品种的顶尖(叶)和根(brei)组织里的水平.这些 被注意到的微小差异不可能具有生物学意义,所以,我们认为,抗农达?甜菜转化 体H7-1的地上叶片组织和根组织和常规甜菜没有差异,综合统计分析结果见表22、 表23、表24、表25. 孟山都公司申请书_H7-1 74 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 氨基酸 (% 氨基酸总含量) Alanine (%) 对照 6.44 ± 0.11 6.18,6.70 丙氨酸 (6.29 - 6.61) H7-1 6.67 ± 0.11 6.41,6.93 0.23 ± 0.088 0.025,0.43 0.032 (6.29 - 7.07) 参照品系 6.53 ± 0.075 6.36,6.71 (5.98 - 6.97) Arginine (%) 对照 5.36 ± 0.13 5.06,5.65 精氨酸 (5.13 - 5.69) H7-1 5.44 ± 0.13 5.15,5.74 0.086 ± 0.084 -0.11,0.28 0.334 (5.06 - 5.91) 参照品系 5.42 ± 0.13 5.11,5.72 (4.68 - 5.96) Aspartic acid (%) 对照 10.29 ± 0.18 9.87,10.70 天冬氨酸 (10.16 - 10.36) H7-1 10.53 ± 0.18 10.11,10.95 0.24 ± 0.17 -0.15,0.64 0.196 (9.96 - 11.37) 参照品系 10.55 ± 0.19 10.10,11.00 (9.55 - 11.40) 孟山都公司申请书_H7-1 75 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值Cystine (%) 对照 1.73 ± 0.28 1.09,2.38 胱氨酸 (1.18 - 2.24) H7-1 1.90 ± 0.28 1.25,2.54 0.17 ± 0.19 -0.27,0.60 0.403 (0.87 - 3.20) 参照品系 1.77 ± 0.13 1.45,2.09 (1.07 - 3.05) Glutamic acid (%) 对照 13.46 ± 0.35 12.66,14.26 谷氨酸 (12.20 - 14.78) H7-1 13.10 ± 0.35 12.30,13.90 -0.36 ± 0.21 -0.84,0.11 0.115 (12.35 - 13.56) 参照品系 13.92 ± 0.30 13.22,14.62 (12.29 - 15.55) Glycine (%) 对照 6.86 ± 0.20 6.40,7.33 甘氨酸 (6.23 - 7.32) H7-1 6.80 ± 0.20 6.33,7.26 -0.064 ± 0.11 -0.32,0.19 0.577 (6.45 - 7.47) 参照品系 6.78 ± 0.16 6.40,7.17 (6.21 - 7.80) 孟山都公司申请书_H7-1 76 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值Histidine (%) 对照 2.46 ± 0.16 2.10,2.83 组氨酸 (2.00 - 2.73) H7-1 2.29 ± 0.16 1.93,2.66 -0.17 ± 0.056 -0.30,-0.042 0.015 (1.73 - 2.54) 参照品系 2.26 ± 0.12 1.98,2.54 (1.75 - 2.68) Isoleucine (%) 对照 4.49 ± 0.11 4.24,4.74 异亮氨酸 (4.26 - 4.86) H7-1 4.39 ± 0.11 4.14,4.64 -0.11 ± 0.053 -0.23,0.014 0.076 (4.12 - 4.67) 参照品系 4.44 ± 0.077 4.25,4.62 (4.11 - 4.97) Leucine (%) 对照 8.20 ± 0.27 7.58,8.81 亮氨酸 (7.58 - 9.19) H7-1 8.13 ± 0.27 7.52,8.75 -0.066 ± 0.079 -0.25,0.12 0.426 (7.66 - 9.06) 参照品系 8.01 ± 0.19 7.57,8.45 (7.16 - 9.01) 孟山都公司申请书_H7-1 77 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值Lysine (%) 对照 5.36 ± 0.32 4.62,6.09 赖氨酸 (4.82 - 5.81) H7-1 5.25 ± 0.32 4.52,5.98 -0.10 ± 0.33 -0.86,0.65 0.759 (3.75 - 5.81) 参照品系 5.35 ± 0.18 4.93,5.76 (4.60 - 5.85) Methionine (%) 对照 1.83 ± 0.34 1.06,2.61 甲硫氨酸 (1.37 - 2.45) H7-1 2.20 ± 0.34 1.42,2.98 0.37 ± 0.24 -0.20,0.93 0.173 (1.13 - 4.05) 参照品系 1.74 ± 0.16 1.36,2.12 (1.06 - 3.18) Phenylalanine (%) 对照 5.12 ± 0.11 4.87,5.37 苯丙氨酸 (4.76 - 5.46) H7-1 4.98 ± 0.11 4.73,5.23 -0.14 ± 0.028 -0.20,-0.073 0.001 (4.65 - 5.30) 参照品系 4.99 ± 0.10 4.76,5.23 (4.47 - 5.40) 孟山都公司申请书_H7-1 78 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值Proline (%) 对照 7.04 ± 0.43 6.05,8.02 脯氨酸 (5.53 - 7.95) H7-1 7.04 ± 0.43 6.06,8.02 0.0016 ± 0.48 -1.10,1.10 0.997 (6.55 - 7.47) 参照品系 7.15 ± 0.31 6.42,7.88 (5.46 - 9.58) Serine (%) 对照 5.80 ± 0.16 5.44,6.16 丝氨酸 (5.48 - 6.24) H7-1 5.94 ± 0.16 5.58,6.30 0.14 ± 0.10 -0.091,0.37 0.198 (5.47 - 6.33) 参照品系 5.78 ± 0.11 5.52,6.05 (5.34 - 6.21) Threonine (%) 对照 4.82 ± 0.19 4.38,5.25 苏氨酸 (4.42 - 5.05) H7-1 4.71 ± 0.19 4.28,5.14 -0.11 ± 0.17 -0.50,0.28 0.538 (4.09 - 5.07) 参照品系 4.47 ± 0.18 4.06,4.89 (3.39 - 5.23) 孟山都公司申请书_H7-1 79 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值Tryptophan (%) 对照 1.60 ± 0.15 1.25,1.95 色氨酸 (1.30 - 1.86) H7-1 1.69 ± 0.15 1.34,2.04 0.093 ± 0.098 -0.13,0.32 0.372 (1.17 - 2.13) 参照品系 1.81 ± 0.11 1.56,2.06 (1.37 - 2.45) Tyrosine (%) 对照 3.65 ± 0.12 3.37,3.92 络氨酸 (3.28 - 3.87) H7-1 3.46 ± 0.12 3.19,3.73 -0.19 ± 0.050 -0.30,-0.074 0.005 (3.05 - 3.69) 参照品系 3.63 ± 0.13 3.32,3.94 (3.21 - 4.70) Valine (%) 对照 5.51 ± 0.16 5.14,5.87 缬氨酸 (5.29 - 6.17) H7-1 5.49 ± 0.16 5.13,5.86 -0.014 ± 0.050 -0.13,0.10 0.789 (5.26 - 5.99) 参照品系 5.37 ± 0.12 5.09,5.66 (4.97 - 6.17) 孟山都公司申请书_H7-1 80 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值Proximate 碳水化合物 (g/kg DW) 对照 521.79 ± 21.98 471.10,572.48 (455.00 - 580.27) H7-1 503.45 ± 21.98 452.76,554.14 -18.34 ± 15.84 -54.86,18.18 0.280 (445.95 - 546.75) 参照品系 489.23 ± 14.44 455.07,523.38 (433.04 - 565.22) 粗灰 (g/kg DW) 对照 194.97 ± 18.30 152.77,237.16 (153.85 - 219.61) H7-1 219.48 ± 18.30 177.28,261.67 24.51 ± 18.75 -18.72,67.75 0.227 (178.39 - 318.98) 参照品系 217.96 ± 10.70 192.65,243.26 (162.00 - 279.09) 粗脂肪 (g/kg DW) 对照 8.73 ± 0.63 7.29,10.17 (7.36 - 11.48) H7-1 9.46 ± 0.63 8.02,10.90 0.73 ± 0.56 -0.55,2.01 0.223 (8.50 - 10.87) 参照品系 10.17 ± 0.98 7.84,12.49 (5.34 - 14.60) 孟山都公司申请书_H7-1 81 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 粗纤维 (g/kg DW) 对照 114.32 ± 12.96 84.44,144.19 (92.30 - 168.23) H7-1 114.95 ± 12.96 85.08,144.83 0.63 ± 4.32 -9.33,10.60 0.886 (85.62 - 159.87) 参照品系 116.20 ± 15.53 79.47,152.92 (78.39 - 197.06) 粗蛋白 (g/kg DW) 对照 160.20 ± 11.23 134.30,186.10 (144.64 - 197.97) H7-1 152.66 ± 11.23 126.76,178.56 -7.54 ± 9.46 -29.36,14.29 0.448 (111.58 - 183.08) 参照品系 166.45 ± 13.21 135.20,197.70 (127.51 - 244.66) 干物质 (g/kg FW) 对照 163.66 ± 10.88 138.57,188.76 (136.90 - 198.34) H7-1 179.81 ± 10.88 154.72,204.91 16.15 ± 5.27 4.00,28.31 0.015 (139.42 - 212.34) 参照品系 161.75 ± 17.80 119.65,203.85 (113.73 - 268.14) 孟山都公司申请书_H7-1 82 表22. 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 抗营养因子 角皂苷 (g/kg FW) 对照 0.065 ± 0.024 0.0089,0.12 (0.047 - 0.10) H7-1 0.10 ± 0.024 0.044,0.16 0.035 ± 0.029 -0.032,0.10 0.260 (0.034 - 0.25) 参照品系 0.076 ± 0.012 0.047,0.10 (0.027 - 0.20) a 对照 = segregant control; H7-1 = Roundup Ready sugar beet event H7-1; 参照品系 = nontransgenic commercial reference varieties. b The least-square mean across the five sites in the 1999 European field trials. 孟山都公司申请书_H7-1 83 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 氨基酸 (% 总氨基酸含量) Alanine (%) 对照 5.29 ± 0.28 4.66,5.93 丙氨酸 (4.69 - 6.33) H7-1 5.91 ± 0.28 5.27,6.54 0.62 ± 0.25 0.049,1.18 0.036 (5.04 - 6.73) 参照品系 6.27 ± 0.34 5.46,7.08 (4.73 - 9.43) Arginine (%) 对照 4.91 ± 0.16 4.55,5.27 精氨酸 (4.50 - 5.18) H7-1 5.30 ± 0.16 4.94,5.67 0.39 ± 0.22 -0.11,0.90 0.110 (4.94 - 5.63) 参照品系 4.80 ± 0.11 4.54,5.06 (4.02 - 5.74) Aspartic acid (%) 对照 13.35 ± 0.39 12.46,14.24 天冬氨酸 (12.32 - 14.75) H7-1 13.21 ± 0.39 12.32,14.10 -0.14 ± 0.18 -0.56,0.28 0.457 (12.66 - 14.46) 参照品系 13.19 ± 0.35 12.35,14.02 (11.57 - 15.53) Cystine (%) 对照 1.38 ± 0.11 1.14,1.63 孟山都公司申请书_H7-1 84 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 胱氨酸 (1.28 - 1.53) H7-1 1.42 ± 0.11 1.17,1.67 0.039 ± 0.15 -0.31,0.39 0.803 (1.25 - 1.72) 参照品系 1.45 ± 0.11 1.18,1.71 (0.84 - 2.28) Glutamic acid (%) 对照 18.58 ± 1.13 15.98,21.18 谷氨酸 (15.66 - 21.85) H7-1 16.87 ± 1.13 14.27,19.47 -1.71 ± 0.52 -2.91,-0.51 0.011 (14.72 - 19.98) 参照品系 19.21 ± 0.95 16.96,21.47 (13.76 - 25.07) Glycine (%) 对照 4.23 ± 0.18 3.82,4.63 甘氨酸 (3.74 - 4.54) H7-1 4.73 ± 0.18 4.32,5.14 0.51 ± 0.23 -0.024,1.03 0.058 (4.15 - 5.21) 参照品系 4.61 ± 0.11 4.36,4.86 (3.83 - 6.18) Histidine (%) 对照 2.69 ± 0.33 1.92,3.46 孟山都公司申请书_H7-1 85 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 组氨酸 (1.58 - 3.33) H7-1 2.95 ± 0.33 2.18,3.72 0.26 ± 0.27 -0.36,0.89 0.361 (2.00 - 3.45) 参照品系 2.87 ± 0.14 2.53,3.21 (1.78 - 3.43) Isoleucine (%) 对照 4.01 ± 0.13 3.72,4.30 异亮氨酸 (3.90 - 4.24) H7-1 4.23 ± 0.13 3.94,4.52 0.22 ± 0.17 -0.17,0.61 0.233 (4.15 - 4.35) 参照品系 3.95 ± 0.094 3.73,4.18 (3.27 - 4.95) Leucine (%) 对照 6.09 ± 0.30 5.40,6.77 亮氨酸 (5.55 - 6.61) H7-1 6.47 ± 0.30 5.79,7.16 0.39 ± 0.30 -0.30,1.07 0.230 (5.90 - 7.18) 参照品系 6.07 ± 0.077 5.89,6.25 (4.82 - 6.95) Lysine (%) 对照 5.42 ± 0.63 3.96,6.87 孟山都公司申请书_H7-1 86 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 赖氨酸 (3.50 - 6.88) H7-1 5.73 ± 0.63 4.27,7.19 0.31 ± 0.42 -0.65,1.28 0.475 (4.29 - 6.52) 参照品系 5.49 ± 0.30 4.77,6.21 (3.69 - 7.11) Methionine (%) 对照 1.35 ± 0.086 1.15,1.55 甲硫氨酸 (1.23 - 1.46) H7-1 1.29 ± 0.086 1.10,1.49 -0.058 ± 0.12 -0.34,0.22 0.646 (1.05 - 1.57) 参照品系 1.28 ± 0.084 1.08,1.48 (0.70 - 2.04) Phenylalanine (%) 对照 3.36 ± 0.16 2.99,3.73 苯丙氨酸 (2.98 - 3.69) H7-1 3.45 ± 0.16 3.08,3.82 0.092 ± 0.18 -0.33,0.51 0.624 (3.29 - 3.66) 参照品系 3.26 ± 0.078 3.08,3.45 (2.75 - 3.75) Proline (%) 对照 5.94 ± 0.49 4.80,7.08 孟山都公司申请书_H7-1 87 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 脯氨酸 (5.53 - 6.46) H7-1 5.39 ± 0.49 4.25,6.53 -0.55 ± 0.70 -2.16,1.06 0.456 (3.29 - 7.02) 参照品系 5.11 ± 0.55 3.82,6.40 (1.71 - 9.29) Serine (%) 对照 7.34 ± 0.33 6.58,8.11 丝氨酸 (6.61 - 8.49) H7-1 7.55 ± 0.33 6.79,8.31 0.20 ± 0.22 -0.31,0.72 0.387 (6.86 - 8.45) 参照品系 7.58 ± 0.22 7.06,8.10 (6.63 - 8.72) Threonine (%) 对照 4.76 ± 0.17 4.38,5.14 苏氨酸 (4.11 - 5.30) H7-1 4.98 ± 0.17 4.60,5.36 0.22 ± 0.15 -0.12,0.56 0.178 (4.51 - 5.28) 参照品系 4.75 ± 0.11 4.48,5.02 (3.96 - 5.51) Tryptophan (%) 对照 2.30 ± 0.59 0.93,3.67 孟山都公司申请书_H7-1 88 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 色氨酸 (1.11 - 4.26) H7-1 1.82 ± 0.59 0.45,3.19 -0.48 ± 0.50 -1.64,0.67 0.364 (1.06 - 2.44) 参照品系 1.93 ± 0.39 1.01,2.84 (1.02 - 5.40) Tyrosine (%) 对照 3.53 ± 0.17 3.13,3.93 络氨酸 (3.27 - 3.86) H7-1 3.55 ± 0.17 3.15,3.95 0.018 ± 0.21 -0.46,0.50 0.933 (3.09 - 4.23) 参照品系 3.34 ± 0.15 3.00,3.69 (2.51 - 4.23) Valine (%) 对照 5.47 ± 0.42 4.50,6.45 缬氨酸 (5.10 - 5.82) H7-1 5.14 ± 0.42 4.17,6.12 -0.33 ± 0.60 -1.71,1.05 0.593 (3.79 - 5.87) 参照品系 4.84 ± 0.31 4.11,5.57 (1.99 - 7.49) Proximate 孟山都公司申请书_H7-1 89 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值 碳水化合物 (g/kg DW) 对照 867.99 ± 7.72 850.18,885.80 (844.36 - 890.16) H7-1 873.05 ± 7.72 855.24,890.86 5.06 ± 3.29 -2.52,12.64 0.162 (855.82 - 890.36) 参照品系 876.23 ± 7.61 858.23,894.24 (833.14 - 900.53) 粗灰 (g/kg DW) 对照 25.43 ± 3.06 18.37,32.49 (17.81 - 32.08) H7-1 25.14 ± 3.06 18.07,32.20 -0.29 ± 1.17 -3.00,2.41 0.808 (17.26 - 33.52) 参照品系 24.10 ± 2.21 18.87,29.33 (17.44 - 38.88) 粗脂肪 (g/kg DW) 对照 2.01 ± 0.49 0.88,3.14 (0.63 - 3.83) H7-1 1.34 ± 0.49 0.22,2.47 -0.67 ± 0.38 -1.54,0.21 0.116 (0.80 - 1.80) 参照品系 1.60 ± 0.15 1.24,1.96 (0.52 - 2.54) 粗纤维 (g/kg DW) 对照 48.37 ± 1.64 44.58,52.16 孟山都公司申请书_H7-1 90 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值(45.72 - 50.42) H7-1 45.38 ± 1.64 41.59,49.17 -2.99 ± 1.52 -6.49,0.51 0.084 (37.25 - 51.96) 参照品系 47.51 ± 1.76 43.33,51.68 (36.49 - 56.87) 粗蛋白 (g/kg DW) 对照 56.19 ± 4.65 45.47,66.92 (41.30 - 69.79) H7-1 55.09 ± 4.65 44.36,65.81 -1.11 ± 2.13 -6.03,3.81 0.617 (45.03 - 65.67) 参照品系 50.56 ± 4.32 40.36,60.77 (37.20 - 69.29) 干物质 (g/kg FW) 对照 240.05 ± 8.80 219.75,260.35 (217.53 - 258.31) H7-1 254.62 ± 8.80 234.32,274.92 14.57 ± 8.93 -6.03,35.17 0.141 (228.67 - 288.78) 参照品系 227.44 ± 8.73 206.80,248.09 (190.50 - 263.31) 质量 孟山都公司申请书_H7-1 91 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值Amino-N (g/100g FW) 对照 0.018 ± 0.0025 0.012,0.024 氨基氮 (0.011 - 0.024) H7-1 0.018 ± 0.0025 0.012,0.023 -0.00010 ± 0.0012 -0.0029,0.0027 0.936 (0.012 - 0.027) 参照品系 0.017 ± 0.0026 0.011,0.023 (0.0088 - 0.035) Invert sugar (g/100g FW) 对照 0.15 ± 0.095 -0.071,0.37 转化糖 (0.043 - 0.53) H7-1 0.14 ± 0.095 -0.074,0.36 -0.0033 ± 0.020 -0.048,0.042 0.869 (0.043 - 0.47) 参照品系 0.12 ± 0.059 -0.020,0.26 (0.030 - 0.53) Polarisation (g/100g FW) 对照 18.12 ± 0.67 16.58,19.67 (16.11 - 19.23) H7-1 18.54 ± 0.67 16.99,20.08 0.41 ± 0.56 -0.87,1.70 0.478 (16.14 - 20.21) 参照品系 17.08 ± 0.62 15.61,18.54 (14.14 - 19.51) 钾K(g/100g FW) 对照 0.15 ± 0.014 0.12,0.18 孟山都公司申请书_H7-1 92 表23 对甜菜根部 (brei) 组织中 氨基酸,近似物与皂角苷的 统计分析结果 (样本采自欧洲 5个田间试验点, 1999年) 差别 (H7-1减对照) 组成分析 品系a 平均值b ± S.E. (范围) 95% CI Mean (Lower, Upper) 平均值 ± S.E. 95% CI (Lower, Upper) p-值(0.12 - 0.19) H7-1 0.15 ± 0.014 0.11,0.18 -0.0040 ± 0.0040 -0.013,0.0052 0.343 (0.12 - 0.20) 参照品系 0.16 ± 0.012 0.13,0.18 (0.11 - 0.21) 钠Na (g/100g FW) 对照 0.015 ± 0.0091 -0.0062,0.036 (0.0060 - 0.042) H7-1 0.013 ± 0.0091 -0.0076,0.034 -0.0013 ± 0.0032 -0.0088,0.0061 0.690 (0.0037 - 0.047) 参照品系 0.014 ± 0.0063 -0.00064,0.029 (0.0043 - 0.055) 角皂苷 (g/kg FW) 对照 0.090 ± 0.018 0.048,0.13 (0.054 - 0.12) H7-1 0.11 ± 0.018 0.069,0.15 0.021 ± 0.011 -0.0052,0.046 0.103 (0.044 - 0.18) 参照品系 0.099 ± 0.011 0.073,0.13 (0.063 - 0.17) a 对照 = segregant control; H7-1 = Roundup Ready sugar beet event H7-1; 参照品系= nontransgenic commercial reference varieties. b The least-square mean across the five sites in the 1999 European field trials. 孟山都公司申请书_H7-1 93 表24 对甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸分析(样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 组成成分 单位 H7-1 Mean (Range)a 对照 Mean (Range)a 参照品种a 氨基酸 Alanine % Total Protein 3.89 4.07 (2.67 - 5.85) 丙氨酸 (3.27 - 5.27) (3.24 - 5.16) Arginine % Total Protein 3.23 3.41 (1.95 - 5.02) 精氨酸 (2.45 - 4.82) (2.72 - 4.59) Aspartic acid % Total Protein 6.17 6.51 (4.55 - 9.86) 天冬氨酸 (5.07 - 8.45) (5.31 - 8.27) Cystine % Total Protein 1.04 1.07 (0.60 - 1.68) 胱氨酸 (0.71 - 1.48) (0.83 - 1.44) Glutamic acid % Total Protein 7.71 8.47 (5.64 - 12.10) 谷氨酸 (5.96 - 11.07) (7.00 - 11.03) Glycine % Total Protein 3.99 4.35 (2.86 - 6.64) 甘氨酸 (3.00 - 5.38) (3.29 - 5.57) Histidine % Total Protein 1.37 1.58 (0.77 - 2.16) 组氨酸 (0.80 - 2.06) (1.05 - 2.09) Isoleucine % Total Protein 2.60 2.86 (1.83 - 4.53) 异亮氨酸 (1.91 - 3.74) (2.29 - 3.74) Leucine % Total Protein 4.83 5.24 (3.27 - 7.65) 亮氨酸 (3.68 - 7.40) (4.17 - 7.41) Lysine % Total Protein 3.13 3.43 (2.07 - 4.66) 赖氨酸 (1.74 - 4.67) (2.65 - 4.68) (下页续) 孟山都公司申请书_H7-1 94 续表24 甜菜顶部 (叶)组织中 氨基酸分析(样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 组成成分 单位 H7-1 Mean (Range)a 对照 Mean (Range)a 参照品种a 氨基酸 Methionine % Total Protein 1.20 1.13 (0.53 - 1.71) 甲硫氨酸 (0.93 - 1.87) (0.86 - 1.29) Phenylalanine % Total Protein 2.95 3.26 (2.03 - 4.85) 笨丙氨酸 (2.28 - 4.33) (2.62 - 4.40) Proline % Total Protein 4.15 4.45 (2.87 - 5.91) 脯氨酸 (3.03 - 5.81) (2.84 - 5.56) Serine % Total Protein 3.46 3.65 (2.44 - 5.07) 丝氨酸 (2.93 - 4.53) (2.95 - 4.42) Threonine % Total Protein 2.79 3.04 (1.41 - 4.29) 苏氨酸 (1.89 - 4.10) (2.52 - 4.01) Tryptophan % Total Protein 0.96 0.98 (0.85 - 1.46) 色氨酸 (0.80 - 1.15) (0.91 - 1.05) Tyrosine % Total Protein 2.05 2.32 (1.34 - 3.32) 酪氨酸 (1.41 - 2.97) (1.73 - 3.01) Valine % Total Protein 3.24 3.51 (2.26 - 5.61) 缬氨酸 (2.44 - 4.47) (2.75 - 4.74) a 对照 = segregant control; H7-1 = Roundup Ready sugar beet event H7-1; 参照品种 = nontransgenic commercial reference varieties. 孟山都公司申请书_H7-1 95 表25 甜菜根部 (brei)组织中 氨基酸分析(样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 组成成分 单位 H7-1 Mean (Range)a 对照 Mean (Range)a 参照品种a 氨基酸 Alanine % Total Protein 2.38 2.26 (1.27 - 4.27) 丙氨酸 (2.15 - 2.67) (1.87 - 3.38) Arginine % Total Protein 2.14 2.07 (1.16 - 3.07) 精氨酸 (1.86 - 2.51) (1.77 - 2.60) Aspartic acid % Total Protein 5.34 5.68 (3.15 - 8.79) 天冬氨酸 (4.62 - 6.10) (4.62 - 7.87) Cystine % Total Protein 0.57 0.59 (0.37 - 0.98) 胱氨酸 (0.52 - 0.70) (0.45 - 0.82) Glutamic acid % Total Protein 6.85 7.78 (5.14 - 13.02) 谷氨酸 (5.55 - 8.57) (5.98 - 8.61) Glycine % Total Protein 1.91 1.78 (1.04 - 2.99) 甘氨酸 (1.58 - 2.24) (1.47 - 2.23) Histidine % Total Protein 1.20 1.13 (0.74 - 1.86) 组氨酸 (0.82 - 1.60) (0.62 - 1.38) Isoleucine % Total Protein 1.71 1.69 (0.88 - 2.53) 异亮氨酸 (1.56 - 1.93) (1.39 - 2.12) Leucine % Total Protein 2.61 2.58 (1.30 - 3.89) 亮氨酸 (2.35 - 2.82) (2.19 - 3.53) Lysine % Total Protein 2.32 2.24 (1.24 - 3.61) 赖氨酸 (1.75 - 3.02) (1.38 - 2.73) (下页续) 孟山都公司申请书_H7-1 96 续表25 甜菜根部 (brei)组织中 氨基酸分析(样本采自欧洲 5点田间试验点, 1999年) 组成成分 单位 H7-1 Mean (Range)a 对照 Mean (Range)a 参照品种a Amino Acid 氨基酸 Methionine % Total Protein 0.52 0.57 (0.31 - 0.99) 甲硫氨酸 (0.42 - 0.64) (0.48 - 0.78) Phenylalanine % Total Protein 1.40 1.43 (0.74 - 1.95) 笨丙氨酸 (1.25 - 1.62) (1.17 - 1.97) Proline % Total Protein 2.17 2.51 (0.80 - 4.48) 脯氨酸 (1.31 - 2.86) (2.29 - 3.34) Serine % Total Protein 3.04 3.13 (1.78 - 4.84) 丝氨酸 (2.58 - 3.44) (2.37 - 4.53) Threonine % Total Protein 2.01 1.99 (1.06 - 2.80) 苏氨酸 (1.81 - 2.44) (1.77 - 2.19) Tryptophan % Total Protein 0.73 0.99 (0.46 - 2.23) 色氨酸 (0.49 - 0.97) (0.46 - 1.68) Tyrosine % Total Protein 1.43 1.48 (0.76 - 2.14) (1.23 - 1.66) (1.26 - 1.74) Valine % Total Protein 2.08 2.30 (0.93 - 3.52) 缬氨酸 (1.51 - 2.42) (2.07 - 2.82) a 对照 = segregant control; H7-1 = Roundup Ready sugar beet event H7-1; 参照品种 = nontransgenic commercial reference varieties. 孟山都公司申请书_H7-1 97 3.3.5 抗生素抗性 在培育H7-1 期间,没有把任何的抗生素抗性编码基因插入甜菜的基因组里.前 述章节有关分子生物学定性数据表明在H7-1 甜菜里不存在aad抗生素抗性标记基 因. 3.3.6 对人体和食品安全性的其他影响 对抗农达H7-1甜菜与常规甜菜品种进行了多年的组成成分分析,以确定其实质 等同性.结果证明,在对人类和动物的健康的影响方面,抗农达H7-1 甜菜和其非转 基因对照具有充分的实质等同性.对抗农达H7-1 甜菜中表达的CP4 EPSPS蛋白的安 全性评价包括通过生物信息学分析,证实与已知的过敏原和毒素没有同源性(报告 8);微生物中产生的CP4 EPSPS蛋白具有长期的安全应用历史,模拟胃肠液中体外 消化试验,证明CP4 EPSPS蛋白在模拟胃肠液中快速消化(报告9);小鼠急性口服 毒性试验结果证明CP4 EPSPS没有急性毒性(报告5). 一个能提高对蛋白口服过敏可能性的因素包括蛋白对胃肠消化的稳定性.蛋白 过敏原如果能达到和通过肠粘液膜,诱发过敏反应的话,它们就应对消化系统内的 胃蛋白酶和酸性条件趋于稳定(Kimber 等, 1999; Astwood 等, 1996; Metcalfe 等, 1996).制备了模拟胃肠液,用于评估CP4 EPSPS蛋白对离体蛋白水解消化的易感 性.制备模拟哺乳动物胃肠液采用的方法,在美国药典里作了介绍(1990).还采用 了一个类似的模型,以检查牛奶过敏原的稳定性(Asselin , 1989).对于模拟消化液, 目前广泛采用离体研究,作为动物消化模型.这些模型一直用来调查植物蛋白 (Nielson, 1988; Marquez和Lajolo, 1981)、动物蛋白(Zikakis 等, 1977)和食品添加剂 (Tilch和Elias, 1984)的可消化性,以评估蛋白品质(Akeson和Stahmann, 1964)、研究猪 禽消化、测量片剂溶解率,以监测其在药品应用中的生物降解特点(Akeson和Stahmann, 1964)和调查受试药物(Doherty等,1991)的缓释特点 采用模拟消化液(Harrison等, 1996)证明了成熟的CP4 EPSPS蛋白可在离体的条件 下迅速降解.Western印记分析的数据证明,CP4 EPSPS蛋白在胃系统里的半衰期为 不到15秒.假使CP4 EPSPS蛋白能通过胃系统而存留下来,它也势必会在肠内迅速 降解.为了正确地实现这一蛋白在模拟胃系统中的迅速降解,对固体食物进行了估 测,发现在二小时内约50%的固体食物能从人胃中排空,而液体食物则需要约25分 钟才能排空50% (Sleisenger和Fordtran, 1989).根据这些结果,预计CP4 EPSPS蛋白 能在哺乳动物消化道里迅速降解. 另有试验分析了CP4 EPSPS蛋白在含有胃蛋白酶的另一种新配方的模拟胃液 (SGF)里的离体可消化性.同上面的第一个研究一样(Harrison 等, 1996),所采用的 CP4 EPSPS蛋白是在大肠杆菌里产生并纯化的.利用SDS-PAGE凝胶染色法、 Western印记分析和EPSPS酶活性分析法,评估了可消化性. 这些试验的结果证明,大肠杆菌产生的成熟CP4 EPSPS蛋白,经过在SGF里培 养后,得到了迅速地消化.SDS-PAGE胶体蓝凝胶电泳证明,大肠杆菌产生的成熟 CP4 EPSPS蛋白至少有98%可在15秒钟内得到消化.没有观察到因消化而产生的退 行性泳带.Western印记分析分析证实,大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白有95%以上 能在15秒内在SGF里被消化.同样还证明,CP4 EPSPS蛋白在SGF里培养时,其活性 在15秒内即能消减到<10%.总而言之,同时作为对先前研究的补充,这三种检测方 法都证明,大肠杆菌产生的CP4 EPSPS蛋白能在模拟胃液里迅速地降解. 孟山都公司申请书_H7-1 98 综合上述这些研究所得的数据与信息,以及其他相关研究,都表明了抗农达? 甜 菜转化体H7-1中的 CP4 EPSPS 蛋白,应用于人类与动物消费是安全的.图15中显示 了有关对抗农达? 甜菜转化体H7-1得出"无顾虑"的评价技术路线,以粗体箭头标 识. 图15 新品种的安全性评估:从供体导入的蛋白质 (摘自美国食品药品监督局(FDA) 食品政策) 3.4 根据上述评价,参照本办法第十三条有关标准划分转基因植物的安全等级 受体生物安全性等级为I 级,基因工程操作类型为2 类,按照农业部转基因生物 安全等级进行的划分. H7-1系是采用安全等级为I的常规甜菜品种3S0057为受体,并通过2型的转化方 法转化后获得的.大量的研究表明H7-1转化体对人类和动物健康以及对生态环境的 安全性的影响与常规品种是一致的.根据《农业转基因生物安全评价管理办法》第 二章第十三条的规定,转cp4 epsps基因抗农达甜菜H7-1的安全等级为I 级. 孟山都公司申请书_H7-1 99 4 转基因植物产品的安全性评价 4.1 生产、加工活动对转基因植物安全性的影响 对选择甜菜品种作为对比食品的评定 H7-1转化体是以KWS的多粒甜菜品种为受体,其代码为3S0057,通过农杆菌介 导法完成转化而得到的.转化后衍生的品系6401VH植株含有H7-1转化体,被应用于 甜菜育种,与其它不同品系杂交(图10、图11).对这些品系应用常规育种方法, 使H7-1转化体与KWS的性状优良的细胞质雄性不育系杂交,而对得到的杂交组合进 行成份分析.进行比较的直接对照是在育种进程中得到的相对应的非转基因分离 系.选择这些品系作对照是因为它们与含H7-1转化体的转基因杂交品种具有相似的 遗传背景.为确立成份分析数值的范围,还设置了一些已商业化的非转基因品种作 为参照. 甜菜的应用情况 在美国,甜菜(Beta vulgaris)是一种重要的作物,在2001年和2002年的生长季里 分别种植了130和140万英亩(USDA-NASS, 2002),其产量相当于世界产量的10%. 主要种植在美国的相对干燥凉爽的地区,但在部分高湿或灌溉区,也可作为轮作作 物.对于糖甜菜的生产来说,是在春季播种,而对于种子生产来说,则要秋季播 种,以使植株在产生种子之前经过一个春化的过程.在秋季进行甜菜根的采收,以 加工成食糖;以及作饲料用的糖蜜和糖渣.收获的甜菜根,依据种植者和加工厂签 订的合同,主要运到加工厂.整个的甜菜块根可以在采收当时进行加工,也可以在 寒冷的条件下储存等待加工.在2000年到2001年之间,有大约1700到1900公吨由甜 菜生产的糖向国外出口,出口价值分别约为60至80万美元. (USDA-FAS, 2002). 甜菜的现代应用情况 栽培甜菜产品的生产与应用非常广泛.甜菜块根极少被直接应用于食品或饲 料,但被加工成糖后应用于食品,或是糖蜜和糖渣作饲料用.鉴于应用的广泛,已 成立了一些专门的信息中心,提供有关甜菜的加工技术、成份分析方法以及质量参 数等等.如: 甜菜新品种成份分析的一致建议书:重要食品与饲料营养与抗营养因子 (OECD,2002); 2)甜菜与制糖技术 (McGinnis, 1982) 目前,已有很多种甜菜加工制糖工艺的应用设计,其典型的工艺流程见诸于 OECD,2002年的报告.甜菜制糖的加工工艺大致含有以下步骤:甜菜块根收获 后,清洗去泥、去杂,切削成丝,于70O C下浸泡水中约100分钟,粗提液经石灰水 与CO2纯化,形成碳酸化糖泥后,再经过滤、压榨与蒸发(98-130O C)后,浓缩, 得到含有晶体的稠浆,再经离心使晶体与糖蜜分离.晶体经干燥、冷却后即为食 糖,贮存 食用或加 工食品.榨糖加工副产品如 糖蜜、糖渣,通常用于饲料 (OECD,2002年报告).这些加工活动不会影响抗农达甜菜的安全性.并且甜菜 的主要加工产品糖极少含有CP4 EPSPS 蛋白. 4.2 转基因产品的稳定性 一个能提高对蛋白口服过敏可能性的因素包括蛋白对胃肠消化的稳定性.蛋白 过敏原如果能达到和通过肠粘液膜,诱发过敏反应的话,它们就应对消化系统内的 孟山都公司申请书_H7-1 100 胃蛋白酶和酸性条件趋于稳定(Kimber 等, 1999; Astwood 等, 1996; Metcalfe 等, 1996).制备了模拟胃肠液,用于评估CP4 EPSPS蛋白对离体蛋白水解消化的易感 性.实验证明采用模拟消化液(Harrison等, 1996) 证明了成熟的CP4 EPSPS蛋白可在 离体的条件下迅速降解.根据转印法分析,这些数据证明,CP4 EPSPS蛋白在胃系 统里的半衰期为不到15秒,在肠系统里不到10分钟.假使CP4 EPSPS蛋白能通过胃 系统而存留下来,它也势必会在肠内迅速降解.为了正确地实现这一蛋白在模拟胃 系统中的迅速降解,对固体食物进行了估测,发现在二小时内约50%的固体食物能 从人胃中排空,而液体食物则需要约25分钟才能排空50% (Sleisenger和Fordtran, 1989).根据这些结果,预计CP4 EPSPS蛋白能在哺乳动物消化道里迅速降解 4.3 转基因植物产品与转基因植物在环境安全性方面的差异 市场应用(所可能引发)的负面效应的推理 经相关研究得出结论,抗农达甜菜H7-1转化体,不会比常规甜菜更可能产生植 物病虫害风险.这是基于以下几方面: (1)病虫害易感性观察证实,H7-1转化体不 会比常规甜菜更易感病虫害;(2)农艺性状、田间表现和形态学数据证明,H7-1转化 体同常规甜菜相比,在形态学和农艺学上并没有明显的差异,这表明H7-1转化体和 常规甜菜,在竞争性和杂草性上没有差异;(3)构成成份与质量因素的分析表明, H7-1转化体在构成成分和抗营养元素上,就结构而言,等同于其对照;(4)在H7-1转 化体和常规甜菜之间观察到的唯一差异,就是CP4 EPSPS蛋白所赋与的草甘膦抗 性.因此,cp4 epsps基因,包括其监控序列,和产生的CP4 EPSPS蛋白,都没有赋 与H7-1转化体任何的植物病虫害特性. 基于以上论述,对于H7-1转化体,孟山都与KWS公司通过大量试验没有得出不 良因素,也不预期其应用会产生负面效应.而根据其推广将会对种植者以及环境产 生的实质效益,孟山都与 KWS 公司已在美国对商业化种植抗农达? 甜菜提出申请, 并于2005年3月16日获得美国农业部的商业化生产许可.因此孟山都和KWS公司请 求中国农业部批准进口抗农达? 甜菜. 4.4 转基因植物产品与转基因植物在对人类健康影响方面的差异 甜菜作为食品来源 甜菜作为食品的主要用途是经过工业加工成食糖 (见报告1).在美国,在榨 糖中产生的糖蜜,因其特有的涩味,不用于人类的食用消费. (T. Schwartze, 食糖 personal communication, 2003). 每年全球由甜菜压榨制得的食糖约有4千万吨,而全 球每年对各种原料制成的食糖的消费约为1亿2千万吨 (OECD, 2002).在美国人的膳 食中食糖是重要的食品原料,人均消费约103磅(含各种制成来源).一位典型的美 国成人每年约消费10磅的由甜菜制成的食糖 (M. Mackey and B. Hammond, Personal communications, 2003). 甜菜作为饲料来源 应用于牲畜饲料也是甜菜的重要用途,主要是在制糖的副产品-糖蜜与糖渣. 它们富含纤维与能量,因而主要用于喂饲反刍动物,如奶牛、肉牛与绵羊,但也用 于喂饲某些非反刍动物.糖渣常被压实、干燥 (85-90% 干物质含量). 为便于储运, 又通常再将之制成颗粒.糖蜜的应用主要是作为饲料成份,或颗粒或青贮饲料中的 添加剂.2000年与2001年,这些由甜菜制成的糖渣,美国分别出口了大约 604,000 吨与674,000吨, 价值分别为 7700万美元,和8700万美元 (USDA-FAS, 2002). 孟山都公司申请书_H7-1 101 CP4 EPSPS 蛋白在商业化种植的食品源作物中的存在 耐除草剂作物,主要是抗农达作物,2002年在全球的播种面积约为四千四百万 公顷 (James, 2002).抗农达大豆自1996年开始的迅速推广就是这种技术广受欢迎的 突出例子.抗农达大豆的商业化种植,从1996年的40万公顷(美国大豆面积的 1%),迅猛发展到1997年的360万公顷 (美国大豆面积的13%),继而一路攀升到 1998年的1020万公顷(美国大豆面积的36%),1999年的1500万公顷(美国大豆面 积的50%),2000年的1650万公顷(美国大豆面积的54%),已至2002年的2330万 公顷,占美国大豆面积的79%(James, 2001; James 2002).全球而言2002年,含CP4 EPSPS 蛋白的抗农达大豆的种植面积大致为3900万公顷,其中1200万公顷是在南美 的阿根廷,300万公顷在加拿大.另外全球还种植了约700万公顷的其他抗农达作物 (James, 2001; James 2002). 抗农达? 甜菜H7-1转化体中的成熟CP4 EPSPS 蛋白的氨基酸序列,与那些已获 批准进行商业化种植的抗农达作物的氨基酸序列,具有高度同源性,一致性达到 99%以上.而后者是抗农达的大豆,玉米(NK603转化体)与油菜,它们已完成了 美国FDA的评审过程,已获准商业化种植了.进言之,转化体H7-1中产生的 CP4 EPSPS 蛋白与之由转化体77产生的,具有完全一致性,而后者已于1998年完成了美 国FDA的评审流程. 综上所述,这些抗农达作物,或者它们的加工产品,自1996年起,已一直作为 食品或饲料,被人类或动物安全地食用 (James, 2002).这表明,有关安全食用抗农 达作物以及它们所含有的CP4 EPSPS 蛋白的大量实践也从侧面佐证抗农达甜菜及其 含有的CP4 EPSPS 蛋白的安全性. 结论 对抗农达甜菜转化体H7-1中的CP4 EPSPS蛋白,进行了研究与评估,已取得数 据与信息来评价其安全性.消化性研究表明转化体H7-1中的CP4 EPSPS蛋白,在体 外模拟消化液环境下很快降解,不太可能引发潜在的毒性反应.生物信息学的分析 结果显示,转化体H7-1中的CP4 EPSPS蛋白与已知能够引发人类或动物健康上负面 反应的那些药理学活性蛋白相比较, 二者不具生物学意义上的结构相关性. 对成 熟的 CP4 EPSPS 蛋白进行急性口服毒理学试验,结果表明无毒性.供体生物- Agrobacterium sp. 小种 CP4, 对人类或动物没有已知的致病性, 不是常见致敏源;并且CP4 EPSPS 蛋白 与 天然 EPSPS相比,除了与草甘膦的亲和性不同外,二者具有功 能上的一致性.此外,农杆菌(Agrobacterium sp.)小种CP4和CP4 EPSPS 蛋白都 已作为安全评价的一部分,抗农达甜菜转化体77已经通过了评审. 实践和经验证实了CP4 EPSPS蛋白食用的安全性,这是因为:转化体H7-1中的 CP4 EPSPS 蛋白具有与食物源作物(如大豆,玉米)中天然EPSPS蛋白的相似性, 也相类于真菌和微生物食品源如酵母(Saccharomyces cerevisiae) 和Bacillus subtilis中 的天然EPSPS蛋白 (Mountain, 1989; Padgette et al., 1996; Harrison et al., 1996). 同时,目前已有相当数量的其它抗农达食品源作物,如大豆、玉米(NK603转化体) 与油菜,先期完成了FDA的评审流程,也获得了在中国作为加工原料的进口安全 书. 孟山都公司申请书_H7-1 102 4.5 参照本办法第十四条有关标准划分转基因植物产品的安全等级. 根据农业部转基因生物的安全等级和产品的生产、加工活动对其安全等级的影 响程度,孟山都公司、KWS 公司通过对受体、基因操作、转基因植物及转基因产品 的安全进行了全面的评估(包括基因操作、环境、生态、毒性、食品安全等),认 为转cp4 epsps 基因 H7-1 抗农达甜菜加工产品的安全等级为 I 级. 孟山都公司申请书_H7-1 103 参考文献 1. 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Bestimmung des Saponingehaltes in Zuckerfabriksprodukten und Verhalten w?hrend des Prozesses. CITS 19th General Assembly. Cambridge. 82. Schulz, A., A. Krüper, and N. Amrhein. 1985. Differential sensitivity of bacterial 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases to the herbicide glyphosate. FEMS Microbiology Letters 28:297-301. 83. Sheperd, R.J., J.F. Richins, J.F. Duffus, and M.K. Handley. 1987. Figwort mosaic virus: properties of the virus and its adaptation to a new host. Phytopathology 77:1668-1673. 84. Shin, D. S., C.M. Compadre, S.J. Maleki, R.A. Kopper, H. Sampson, H., Huang, S. K., Burks, A.W., and G.A. Bannon. 1998. Biochemical and structural analysis of the IgE binding sites on Ara h1, an abundant and highly allergenic peanut protein. J Biol Chem 273:13753-13759. 85. Sjoblad R.D., J.T. McClintock, and R. Engler. 1992. Toxicological considerations for protein components of biological pesticide products. Regulatory Toxicology and Pharmacology 15:3-9. 86. 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The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5- enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 94:1207-1212. 91. Sutcliffe, J.G. 1979. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symposium 43:77-90. 92. Tilch, C. and P.S. Elias. 1984. Investigation of the Mutagenicity of Ethylphenylglycidate. Mutation Research 138:1-8. 93. Timko, M. P., L. Herdies, E. de Alameida, A. R. Cashmore, J. Leemans, and E. Krebbers. 1988. Genetic engineering of nuclear-encoded components of the photosynthetic apparatus of Arabidopsis. pp. 279-295. In The Impact of Chemistry on Biotechnology - A Multidisciplinary Discussion. M. 孟山都公司申请书_H7-1 108 Phillips, S. P. Shoemaker, R. D. Middlekauff, and R. M. Ottenbrite, editors. ACS Books, Washington, DC. 94. United States Pharmacopeia, Vol. XXII, NF XVII. 1990. United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD. pp. 1788-1789. 95. USDA-FAS. 2002. United States Department of Agriculture, Foreign Agricultural Service. World Wide Website (http://www.fas.usda.gov). 96. USDA-NASS. 2001. Agricultural Chemical Usage: 2000 Field Crops Summary. United States Department of Agriculture, National Agricultural Statistics Service, Washington, DC. Ag Ch 1 (01) b, May. 97. USDA-NASS. 2002. Acreage: 2001 Summary. United States Department of Agriculture, National Agricultural Statistics Service, Agricultural Statistics Board, Washington, DC. Cr Pr 2-5 (6-02), June. 98. WSSA, 1994. Herbicide Handbook, 7th edition. Ed. William H. Ahrens. Weed Society of America, 1508 West University Avenue. Champaign, Illinois. ISBN# 0-911733-18-3. 99. Zikakis, J.P., S.J. Rzucidlo, and N.O. Biasotto. 1977. Persistance of Bovine Milk Xanthine Oxidase Activity After Gastric Digestion In Vivo and In Vitro. J. Dairy Science 60: 533-541. 100. Zollinger, R.K. 2000. North Dakota Weed Control Guide. NDSU Extension Service. Copy available on the Internet at the World Wide Website: (http://www.ext.nodak.edu/extpubs/plantsci/weeds/w253/w253w.htm) 孟山都公司申请书_H7-1 109 六、相关附件资料 为了与正文区分,本附件部分图标重新编号为附图1、附图2或附表1、附表2等. 1、目的基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列 H7-1目的基因 cp4 epsps基因:许多文献已证明该基因引入植物体后,能编码CP4 EPSPS 蛋白,使植物耐受草甘膦类除草剂 (Padgette et al., 1996; OECD, 1999) .已成功 在大豆、玉米、棉花、油菜等多种作物上利用.cp4epsps基因的核苷酸序列附图1. 目的基因 cp4espes的核苷酸序列(商业保密资料) 由cp4 epsps编码序列推导出了在H7-1里的植物产生的CP4 EPSPS蛋白的氨基酸序 列:. 1 MLHGASSRPA TARKSSGLSG TVRIPGDKSI SHRSFMFGGL ASGETRITGL LEGEDVINTG 61 KAMQAMGARI RKEGDTWIID GVGNGGLLAP EAPLDFGNAA TGCRLTMGLV GVYDFDSTFI 121 GDASLTKRPM GRVLNPLREM GVQVKSEDGD RLPVTLRGPK TPTPITYRVP MASAQVKSAV 181 LLAGLNTPGI TTVIEPIMTR DHTEKMLQGF GANLTVETDA DGVRTIRLEG RGKLTGQVID 241 VPGDPSSTAF PLVAALLVPG SDVTILNVLM NPTRTGLILT LQEMGADIEV INPRLAGGED 301 VADLRVRSST LKGVTVPEDR APSMIDEYPI LAVAAAFAEG ATVMNGLEEL RVKESDRLSA 361 VANGLKLNGV DCDEGETSLV VRGRPDGKGL GNASGAAVAT HLDHRIAMSF LVMGLVSENP 421 VTVDDATMIA TSFPEFMDLM AGLGAKIELS DTKAA 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 孟山都公司申请书_H7-1 110 2. 目的基因与载体构建的图谱 插入序列包含有cp4 epsps基因表达盒,大小约为3.4kb.该表达盒包括35S 启动子 (P-FMV,大小0.672kb)、拟南芥叶绿体转移肽序列(CTP2,大小0.31kb)、cp4 epsps 基因(大小1.363kb)和豌豆rbc-E9(E9 3',大小0.63kb).目的基因与PV-BVGT08载 体构建的图谱见附图1,所含遗传元件的功能、大小和来源详见下表. PV-BVGT08 中包含的基因组成的一览表 基因成分 大小 (kb) 描述 右边界 0.025 一个作为DNA转入植物细胞的初始点的21-25 bp核苷酸,系从A. tumefaciens 质粒pTiT37分离出来(Depicker et al., 1982). P-FMV 0.672 来自于经修饰的玄参花叶病毒(FMV)的35S基因启动子 (Sheperd et al., 1987; Richins et al., 1987; Gowda et al., 1989; Sanger et al., 1990). ctp2 0.31 来自于Arabidopsis thaliana cp4 epsps 编码区的N-端点叶绿体过渡肽 序列(Timko et al., 1988). cp4 epsps 1.363 T来自于农杆菌小种CP4的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 (EPSPS) (Padgette et al., 1995). E9 3' 0.63 Pisum sativum rbcS E9 基因的3'端,含有能指挥mRNA加工和多腺苷 酸化的诸多多腺苷酸化位点 (Coruzzi et al., 1984; Morelli et al., 1985). 左边界 0.025 一个21-25bp的核苷酸序列,它能确定T-DNA转入植物细胞的边 界,最先系从 A. tumefaciens 质粒pYil5955里分离出来,系为鱆鱼碱 类质粒pTiA6 (Barker et al., 1983). ori-V 0.393 一个DNA重复的无性来源,原先从质粒PK2中分离出来(Rogers et al., 1987). ori-322 0.629 DNA重复的一个质粒来源,能使质粒保持在大肠杆菌等细菌寄主体 内(Sutcliffe, 1979). rop 0.191 质粒pBR322R 的一个片段,能抑制RNA引子的形成,而RNA引子 对于质粒能否保持在大肠杆菌等细菌寄主体内是至关重要的(Bolivar et al., 1977; Cesareni et al., 1982). aad 0.789 细菌基因,能为Tn7 AAD 3' 腺嘌呤转移酶编码,使之具有对放线 菌素和链霉素的抗性 (Fling et al., 1985). 孟山都公司申请书_H7-1 111 附图1. PV-BVGT08 质粒载体构建示意图 PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border ori-V rop ori-322 aad Right Border P-FMV ClaI 2406 XhoI 2389 NotI 2380 PstI 2368 BamHI 1702 KpnI 1700 SacI 1694 EcoRI 1684 SacI 1680 PstI 1151 PstI 6540 PstI 7479 HindIII 7972 SacI 7982 EcoRI 8102 EcoRI 8505 XbaI 8571 BglII 8577 HindIII 8583 ClaI 8590 HindIII 5 KpnI 814 PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border ori-V rop ori-322 aad Right Border P-FMV ClaI 2406 XhoI 2389 NotI 2380 PstI 2368 BamHI 1702 KpnI 1700 SacI 1694 EcoRI 1684 SacI 1680 PstI 1151 PstI 6540 PstI 7479 HindIII 7972 SacI 7982 EcoRI 8102 EcoRI 8505 XbaI 8571 BglII 8577 HindIII 8583 ClaI 8590 HindIII 5 KpnI 814 孟山都公司申请书_H7-1 112 3. 目的基因与植物基因组整合及其表达的分子检测或鉴定结果(PCR检测、Southern 杂交分析、Northern或Western分析结果、目的基因产物结果) 本附件资料项下包括以下内容: - H7-1插入序列及其相邻的基因组侧翼序列的PCR分析结果; - H7-1插入序列及基因组侧翼序列(CBI); - H7-1插入片段、基因组侧翼片段和酶切位点线性示意图; - H7-1插入和拷贝数的Southern杂交分析结果; - H7-1中不含质粒骨架序列以及插入序列完整性的Southern杂交验证 - H7-1插入序列世代稳定性的Southern杂交分析; - H7-1中CP4 EPSPS蛋白表达量的ELISA分析; - H7-1不同世代中CP4 EPSPS蛋白的表达稳定性分析. H7-1插入序列及其相邻的基因组侧翼序列的PCR分析结果 甜菜(Beta vulgaris)经过遗传修饰,使其能够表达5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合 成酶蛋白或CP4EPSPS ( CP4 ) 蛋白,该蛋白具有抗草甘膦除草剂(即农达,Roundup? 2 ) 的特性,同时也可作为选择标记.该转基因品系是采用农杆菌(Agrobacterium)介导转化技术导入二元载体PV-BVGT08产生的.用于甜菜转化的载 体包含下列序列(从左边界区域至右边界区域):编码序列包括结合到玄参花叶病毒 启动子(pFMV)调控的cp4epsps编码序列的拟南芥(Arabidopsis thaliana)epsps叶绿 体转运肽编码序列(命名为ctp2),以及豌豆(Pisum sativum)sbcS E9基因3'转录终止 序列.对H7-1插入片段的左右两侧的侧翼基因组序列进行了分子分析. 采用反向PCR技术、序列分析和PCR分析,证明了抗草甘膦甜菜转化事件H7-1含有 一个T-DNA插入.该插入序列含有一个拷贝的cp4 epsps表达盒,位于PV-BVGT 08左右 边界序列之间.通过反向PCR分析了插入序列与植物基因组之间5'和3'接合处的序列. 转化事件H7-1不含有可检测到的质粒骨架序列,插入序列之外的序列与非转基因植株 种的基因组序列是一致的. 右接合点之外基因组DNA的分析: 利用引物组合P3(其中一个引物位于H7-1插入序列内部)(附图2),以转化事件 H7-1 DNA和非转基因对照植株DNA为模板的PCR实验,只在转化事件H7-1 DNA中产 生一个片段. 相反,利用引物组合P3(与插入序列之外的序列同源),在转化事件H7-1和非转 基因对照DNA上都产生扩增片段.这些结果见附图3. 这些结果表明:插入序列右接合点相邻的序列出现在转基因转化事件H7-1 DNA和 非转基因植株DNA中.可以得出结论认为,转化事件H7-1插入序列右接合点之外的这 个DNA片段为非转基因的基因组DNA. 2 Roundup Ready? 是孟山都公司的商标. 孟山都公司申请书_H7-1 113 附图2. 用引物P1、P2、P3和P4的引物组合对H7-1插入序列及其相邻的基因组侧翼序列 进行分析. 数字54、294、3779、4165、60、347、3547和4397分别代表引物组合中核苷酸序列在甜菜H7- 1基因组侧翼中的起始位点. P1组合:分析右边界区域外基因组DNA的引物: 上游引物: 下游引物: 预期PCR产物大小241 bp P2组合:分析左边界区域外基因组DNA的引物: 上游引物: 下游引物: 预期PCR产物大小377 bp P3组合:分析转基因与植物基因组DNA接合点的引物: 上游引物: 下游引物: 预期PCR产物大小288 bp P4组合:分析右边界区域外基因组DNA的引物: 上游引物: 下游引物: 预期PCR产物大小751 bp 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 孟山都公司申请书_H7-1 114 附图3. 对插入序列的右边界区域外基因组DNA的PCR分析 约50ng的染色体DNA、非转基因对照的DNA以及用水做的对照用P1引物组合的PCR(两个引物 都在插入区域以外),以及用P3引物组合(一个引物在插入区域内,另一个在插入区域外)的PCR结果. 左接合点之外基因组DNA的分析: 利用引物组合P4(其中一个引物位于CP4 EPSPS插入序列内部),以转化事件H7-1 DNA和非转基因对照植株DNA为模板的PCR实验,只在转化事件H7-1 DNA中产生一个 片段.相反,利用引物组合P2(与插入序列之外的序列同源),在转化事件H7-1和非 转基因对照DNA上都产生扩增片段.这些结果见附图4. 这些结果表明,插入序列左接合点相邻的序列出现在转基因转化事件H7-1 DNA和 非转基因植株DNA中.可以得出结论认为,转化事件H7-1插入序列左接合点之外的这 个DNA片段为非转基因的基因组DNA 孟山都公司申请书_H7-1 115 附图4. 对插入序列的左边界区域外基因组DNA的PCR分析. 约50ng的染色体DNA、非转基因对照的DNA以及用水做的对照用P2引物组合的PCR(两个引物 都在插入区域以外),以及用P4引物组合(一个引物在插入区域内,另一个在插入区域外)的PCR结果. 结论 所有结果都表明,抗草甘膦甜菜转化事件H7-1插入序列之外的序列与非转基因植 株的序列相同.可以得出结论认为,这些序列是用于转化的亲本品系和其他常规甜菜 品系植物基因组的序列. H7-1插入序列及基因组侧翼序列 对甜菜H7-1插入序列及其基因组序列进行了测序,外源基因(包括启动子、终止 子、目的基因、标记基因等)插入染色体的旁侧序列如下(商业保密资料).其中1- 357bp为5'侧翼序列;358-1087bp为右边界序列,1088-2552bp为目的基因编码序列; 2553-3072bp为左边界序列;3073-3778bp为3'侧翼序列. 116 H7-1插入片段、基因组侧翼片段和酶切位点线性示意图 Southern杂交所用内切酶包括XbaI, ClaI,HindIII PstI.ClaI在质粒上有两个酶切位 点,分别位于质粒的8590碱基和2406碱基,XbaI在质粒上存在1个酶切位点即8571碱基,HindIII在质粒上存在3个酶切位点,分别位于碱基5,7974,8583,PstI在质粒上存 在4个酶切位点,碱基数依次为:1151,2368,6540和7479.附图5为四个内切酶消化 H7-1植物基因组DNA的消化片段. 附图5. H7-1转化体中的DNA插入序列线性示意图 ctp2 P-FMV - E 9 3' LB RB BamH I ClaI ClaI PstI PstI XbaI HindIII HindIII vector DNA hybridizing fragments: HindIII H indIII 5.2 kb XbaI XbaI 4 kb BamHI BamH I 11 kb PstI PstI PstI 4.9 kb 1.2 kb ClaI ClaI ClaI 2.4 kb E9 probe cp4 epsps probe P-FMV probe P-FMV::ctp2::cp4 epsps::E9 probe cp4 epsps ctp2 P-FMV - E 9 3' LB RB BamH I ClaI ClaI PstI PstI XbaI HindIII HindIII vector DNA hybridizing fragments: HindIII H indIII 5.2 kb HindIII H indIII 5.2 kb XbaI XbaI 4 kb XbaI XbaI 4 kb BamHI BamH I 11 kb BamHI BamH I 11 kb PstI PstI PstI 4.9 kb 1.2 kb PstI PstI PstI 4.9 kb 1.2 kb ClaI ClaI ClaI 2.4 kb ClaI ClaI ClaI 2.4 kb E9 probe cp4 epsps probe P-FMV probe P-FMV::ctp2::cp4 epsps::E9 probe cp4 epsps 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 孟山都公司申请书_H7-1 117 H7-1插入和拷贝数的Southern杂交分析结果 甜菜(Beta vulgaris)经过遗传修饰,使其能够表达5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合 成酶蛋白或CP4EPSPS(CP4)蛋白,该蛋白具有抗草甘膦除草剂,同时也可作为选择 标记.该转基因品系是采用农杆菌(Agrobacterium)介导转化技术导入二元载体 pMON17227(以后定名为PV-BVGT08)产生的.用于甜菜转化的载体包含下列序列 (从左边界区域至右边界区域):玄参花叶病毒启动子(pFMV)调控的cp4epsps编码 区域和E9-3'转录终止序列. 对抗草甘膦甜菜转化事件H7-1中存在的插入DNA进行了分子特征分析.特别是确 定了插入片段的数目(在甜菜基因组中的整合位点数目)以及拷贝数(一个插入位点 的整合DNA片段数目). 在T-DNA里,在左边界和右边界序列之间的PstI酶切可以产生两个片段(附图 5),其中一个PstI位点在cp4 epsps编码区域内,用PstI酶切之后,预计利用cp4 epsps探 针能检测到二个杂交片段.一个预期的片段约为1.2kb,第2个片段应含有一个带有甜菜 基因组的融合区约为4.9kb.如附图6所示,Southern杂交分析只得到了预期的两条片段 (附图6,泳道3),因此在基因组中只有一个插入拷贝.证实了在H7-1转化体里只有 插入DNA的一个拷贝. 对来自于H7-1的DNA,利用ClaI进行了酶切(附图5),在插入的P-FMV::ctp2::cp4 epsps::E9 3' 基因盒里,ClaI 酶切二次 (附图6, 泳道 6).正如预期的,只有一个2.4kb的 单一片段同cp4 epsps探针杂交.这一结果还表明了整合DNA片段的完整性. 孟山都公司申请书_H7-1 118 附图6. H7-1 转化体的Southern blot 分析: 插入位点及拷贝数分析 探针用32 P标记,每泳道加样量为~10 ?g经酶切的DNA,各泳道加样如下: 泳道1,质粒PV-BVGT08(BamHI); 泳道2,分子量标记; 泳道3,H7-1(PstI); 泳道4,H7-1(HindIII); 泳道5:H7-1(Xbal); 泳道6,H7-1(ClaI); 泳道7,H7-1(BamHI); 泳道8,非转基因对照; 泳道9,分子量标记 用PstI、HindIII、XbaI、ClaI和BamHI对10 μg的H7-1基因组DNA进行酶切(泳道3至7). BamHI酶切的未转化基因组DNA作为负对照(泳道8).BamHI酶切的pMON17227质粒作为正 对照.泳道2和9为片段大小标记.印迹用32 P-标记的cp4epeps编码区进行检测.探针为cp4epeps 基因内部序列的447-1555 bp. Pst I Marke r Hind III Xba I Cla I Bam HI neg. Control Marker PV-BVGT08 Bam HI 5634 bp 3609 bp 2938 bp 2319 bp 1416 bp 1050 bp 7378 bp 15000 bp 4360 bp 9007 bp 803 bp 554 bp 375 bp 234 bp 1810 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 unspecific background signals 孟山都公司申请书_H7-1 119 H7-1中不含质粒骨架序列以及插入序列完整性的Southern杂交验证 质粒骨架的鉴定方法采用Southern杂交,以骨架序列为探针与酶切的基因组DNA进 行杂交,来检测骨架序列的存在与否.同样的,采用Southern杂交,对插入序列的启动 子区完整性和终止子区完整性进行了分析,来验证插入序列的完整性. 按照以前所示方法提取DNA,利用限制性内切酶XbaI(酶切位点为:8571)消化基 因组DNA,该内切酶在骨架序列中不存在酶切位点. 附图7:转化事件H7-1的Southern杂交分析:插入序列的完整性 用HindIII和BamHI酶切释放出cp4 epeps基因(附图5),印迹用PCR产生的cp4 epeps片段进行检 测.负对照(泳道3和6)没有显示任何杂交条带.转化事件H7-1的基因组DNA和pMON17227 质粒与非转基因DNA混合,都产生一条与预期大小相应的大约1.7 kb片段.用XbaI酶切产生预 期的8.6 kb线性pMON17227质粒片段.对于转化事件H7-1,酶切产生了大约4.0 kb边界片段. 此外,负对照没有出现任何信号. H 7 - 1 H 7 - 1 P V - B V G T 0 8 P V - B V G T 0 8 n e g .c o n tro l n e g .c o n tro l M a rk e r X ba1 H indIII/Bam H I 1 2 3 4 5 6 7 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 9007 4360 孟山都公司申请书_H7-1 120 附图8. 转化事件H7-1的Southern杂交分析:启动子区的完整性. 用HindIII、Xba和SacI/XhoI对10 μg的H7-1基因组DNA、非转基因对照DNA和混有pMON17227 的非转基因对照DNA进行酶切.印迹用32 P-标记的启动子片段(HindIII)(=pMON17227序列:7972-8583 bp),或完整的启动子-cp4epeps-PCR-终止子-表达盒(PmeI/XhoI)(= pMON17227序列:7935-2389 bp)进行检测. 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 H7-1 H7-1 PV-BVGT08 PV-BVGT08 neg.control neg.control M arker Xba1 HindIII 1 2 9 4 5 6 7 probe: promotor-fragment probe: promotor-cp4epsps-E9`3 M arke r H7-1 PV-BVGT08 neg.control 8 3 10 11 SacI/XhoI Unspecific background signals XbaI 孟山都公司申请书_H7-1 121 附图9. 转化事件H7-1的Southern杂交分析:终止子区的完整性 用EcoRI/PstI、XbaI、HindIII和PstI对10 μg的H7-1基因组DNA、非转基因对照DNA和混有 pMON17227的非转基因对照DNA进行酶切.印迹用32 P-标记的终止子片段(EknHI/XhoI)(相 对于pMON17227序列:1702-2389 bp)进行检测. 总之,Southern杂交分析结果证明,转化DNA的所有元件都是完整的,转化事件 H7-1含有一个完整的cp4 epsps编码区. H7-1 H7-1 PV-BVGT08 PV-BVGT08 neg.control neg.control Marker Hind III Pst I 8 9 10 14 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980 bp 9007 4360 PV-BVGT08 PV-BVGT08 H7-1 7 H7-1 4 neg.control 3 2 5 neg.control 6 Marker 1 EcoRI/Pst I Xba1 1.2kb Unspecific background signals 11 12 13 XbaI 孟山都公司申请书_H7-1 122 骨架片段检测的分析:通Ti质粒的骨架区定义为以左右边界序列为界的T-DNA之 外的区域,其中包括复制起点(ori)基因,细菌增殖和细菌选择的选择基因.采用农 杆菌介导转化法,骨架片段通常不会被转移到植物基因组中.为了证明转化事件H7-1 中不存在载体DNA,用XbaI对H7-1的基因组DNA、非转基因对照DNA和H7-1+ pMON17227 DNA进行酶切,并用涵盖整个骨架序列的3个重叠PCR产生的探针进行检 测.第4个探针在一个片段中包括整个骨架. 所用的探针在骨架序列中的位置: 探针1:2730-5370 bp 探针2:5278-6419 bp 探针3:6302-7851 bp 探针4:2730-7851 bp 附图10. 用作探针的骨架片段 用XbaI对10 μg的H7-1基因组DNA、非转基因对照DNA和混有pMON17227的非转基因对照 DNA进行酶切.印迹也用32 P-标记的含整个pMON17227骨架的探针(探针1- 4)进行检测.一 个印迹用标记的cp4epsps片段进行检测. 孟山都公司申请书_H7-1 123 附图11. H7-1 转化体Southern blot 分析: 骨架分析 Shouthen杂交分析的结果:H7-1基因组DNA酶切产物(泳道6、10、14和18)用骨架片段检测,没 有发现任何杂交条带.只有H7-1基因组DNA与pMON17227 DNA混合样本(泳道4、8、12、16和20)出现预期的8.6 kb条带.该条带表示线性化的pMON17227 DNA. H7-1基因组DNA和H7-1基因组DNA与pMON17227 DNA混合样本(附图11,泳道 2和4)与cp4 epsps片段杂交表现出杂交信号.泳道2的4 kb条带表示右边界片段,泳道4 的两个条带为4 kb右边界片段和8.6 kb线性化的pMON17227质粒.两条带表现相同的强 度.这明确地表明,添加的pMON17227 DNA的浓度与H7-1 DNA中cp4 epsps元件的浓 度相当.所用的质粒DNA的浓度相当于0.5个拷贝.如果H7-1基因组中整合了骨架序列, 应能够检测到更清晰的信号. 这些结果证明,H7-1不含有任何可检测到的转化所用的质粒的骨架序列. 孟山都公司申请书_H7-1 124 H7-1插入序列世代稳定性的Southern杂交分析 为了确定整合DNA的稳定性,原始转化事件H7-1与该品系自交或与非转基因甜菜 品系杂交的3个后代品系(64801H、74901H和830023;见附图12)进行了比较.原始 转化品系及其后代产生于1995年、1996年、1997年和1998年. 附图12. H7-1育种系谱图 作为对照,分析了4个不同的非转基因甜菜品系(3S0057、5R7150、8K1180和6S0085).全部DNA样本分别用XbaI、HindIII和BamHI酶切,然后与标记的cp4 epsps 片段杂交.为了证明T-DNA是否稳定地被整合进植物基因组,用相同限制性内切酶酶 切的全部泳道的H7-1后代应表现完全相同大小的条带. 泳道3和6的H7-1后代DNA样本表现预期的片段:用BamHI酶切DNA产生大小约为 11 kb的条带,用XbaI酶切产生4.0 kb的条带,用HindIII酶切产生5.2 kb的条带.相同内 切酶但不同年份材料产生的条带大小都是一致的.全部非转基因品系都没有出现任何 信号(附图13). 这些结果表明,导入序列被稳定地整合进基因组DNA并可稳定地遗传. 1995年:原始转化事件: 6401VH 扩繁 1996年:分离材料 64801H 扩繁 只用入选的抗性植株 74922H 74901H 1997年:分离材料 纯合植株自交 1998年:纯合品系 83002S 125 附图13. H7-1 转化体Southern blot 的分析: 世代稳定性分析 10 ?g转化体H7-1基因组DNA,最初转化体6401VH (H7-1 – 1995),三个后代64801H (H7-1 – 1996)、74922H (H7-1 – 1997)和83002S (H7-1 – 1998)]及非转基因对照DNA用BamHI, XbaI 和HindIII进行酶切.印迹斑用32 P标记的cp4 epsps探针(相当于PV- BVGT08质粒447bp-1555bp) 进行探测. XbaI HindIII neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980bp 9007 4360 neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI Unspecificbackgroundsignals BamHI Unspecific background signals 孟山都公司申请书_H7-1 126 总之,针对H7-1转化体进行的各种观察与研究,包括Southern杂交分析和以表现型 观察为基础的分离数据,都是相互一致的,证明了H7-1不含任何可检测到的骨架序 列.用Southern杂交分析证实的插入片段的分子稳定性,已通过三代得到了证明.这些 结果和上述的遗传稳定性数据以及分子生物学的分析结果相一致. H7-1中CP4 EPSPS蛋白表达量的ELISA分析 为了评价不同试点和处理条件下抗草甘膦甜菜转化事件H7-1组织中CP4 EPSPS蛋 白水平,在欧洲不同试点田间试验种植地(生产计划99-GLY-01 UK/F/D/Sp/It和99- GLY-02 B)采集了包括未处理和农达除草剂处理的抗草甘膦甜菜转化事件H7-1样本 (分别为处理1和2)和H7-1的阴性分离(负对照). 为了评价甜菜组织提取液中CP4 EPSPS蛋白的水平而设计和验证了一种直接双抗夹 心酶联免疫分析方法(ELISA).蛋白值表示为每克鲜重组织的蛋白微克数(μg/g fwt).报告的CP4 EPSPS蛋白水平经过了方法偏差的校正,这已经在ELISA验证期间 被确定了. 作为对偏差的控制,采集了抗草甘膦甜菜转化事件H7-1植株的非转基因甜菜分离 后代的叶片和根组织,采用与抗草甘膦甜菜组织相同的分析方法进行分析.这些非转 基因分离后代具有相似的遗传背景,作为抗草甘膦甜菜转化事件H7-1植株比较的负对 照. 附表1中为每个叶片和根样本估计的CP4 EPSPS蛋白水平.全部蛋白值的单位为 μg/g fwt,并对方法偏差进行了修正.显示的范围表示全部试点CP4 EPSPS蛋白最高和 最低浓度. 由于甜菜叶片和根组织与生产安全性密切相关,所以对其中的CP4 EPSPS蛋白水平 进行了测定. 转化事件H7-1叶片组织中的CP4 EPSPS蛋白水平: 全部试点和处理抗草甘膦甜菜转 化事件H7-1植株叶片组织CP4 EPSPS蛋白的平均水平(±SD)为172 ± 35.9 μg/g fwt(附表1),范围在102-307 μg/g fwt之间.处理1和处理2全部试点的平均水平分别为183 ± 33.5和161 ± 37.8 μg/g fwt.处理1的范围在117-264 μg/g fwt之间,而处理2的范围在102 -307 μg/g fwt之间. 转化事件H7-1根组织中的CP4 EPSPS蛋白水平: 全部试点和处理抗草甘膦甜菜转化 事件H7-1植株根组织CP4 EPSPS蛋白的平均水平(±SD)为168 ± 23.5 μg/g fwt(附表 1),范围在89.7-233 μg/g fwt之间.处理1和处理2全部试点的平均水平分别为154 ± 19.4和181 ± 19.6 μg/g fwt.处理1的范围在89.7-175 μg/g fwt之间,而处理2的范围在 116-233 μg/g fwt之间. 孟山都公司申请书_H7-1 127 附表1. H7-1组织中CP4 EPSPS蛋白含量 组织 品种名 蛋白表达量(?g/g fwt)1 表达量范围(?g/g fwt)3 CP4 EPSPS 均值(标准差)2 CP4 EPSPS 叶片 H7-1(处理1&2) 172±35.9 102 – 307 H7-1(处理1)4 183±33.5 117 – 264 H7-1(处理2)5 161±37.8 102 -307 阴性分离7 ?LOD6 NA8 根H7-1(处理1&2) 168±23.5 89.7 – 233 H7-1(处理1) 154±19.4 89.7 – 175 H7-1(处理2) 181±19.6 116 – 233 阴性分离7 ?LOD6 NA8 注: 1. 全部蛋白值的单位为每克新鲜组织中蛋白的微克量(μg/g fwt); 2. 均值和标准差是通过每个试点每个处理取 3 个重复得到的; 3. 每个试点分析样品中的最大和最小值; 4. 试点中不喷洒农达除草剂的处理 1 组; 5. 试点中喷洒农达除草剂的处理 2 组; 6. 对CP4 EPSPS 蛋白的检测极限在叶子里是 6.01?g/gfwt,根部是 1.20?g/gfwt; 7. 非转基因对照 8. 不适用 结论:cp4 epsps基因在抗草甘膦甜菜H7-1植株中是具有功能的,这一点可被产生 可检测的CP4 EPSPS蛋白所证明.全部试点和处理的叶片组织中CP4 EPSPS蛋白平均水 平为172 ± 35.9 μg/g fwt,而全部试点和处理的根组织中CP4 EPSPS蛋白平均水平为168 ±23.5 μg/g fwt.这些结果表明,草甘膦除草剂处理和未处理的抗草甘膦甜菜叶片组织 中CP4 EPSPS蛋白没有差异.分离的非转基因对照植株不含cp4 epsps编码区但具有抗草 甘膦甜菜转化事件H7-1相同的遗传背景,其叶片和根组织样本中的CP4 EPSPS蛋白水 平均低于LOD. H7-1不同世代中CP4 EPSPS蛋白的表达稳定性分析 利用Chi-方检验分析了不同世代、不同杂交组合抗农达性状的后代分离情况,结果 表明目的基因不同世代分离通过Chi—方检验,没有统计学上的明显差异(附表2), 这同时证明了目的基因稳定地在不同世代表达,其分离符合孟德尔遗传规律,进一步 证明了单一基因位点单拷贝的转化结果. 为了进一步证实目的基因已作为一个插入片段稳定地整合进甜菜H7-1基因组,采用Southern杂交法分析了H7-1转化体及其后三代中提取的基因组DNA.最初的转化体植 株H7-1(6401VH)及其3个后代 (64801H、 74922H和83002S)进行了比较. 这三个后 代是H7-1经自交或与非转基因甜菜品系杂交而得到的后代(附图14、附表2).除此之 外,还利用了四个不同的非转基因甜菜品系作为对照,进行Southern 杂交分析,这四个 品系分别是3S0057, 5R7150, 8K1180 和6S0085, 其中5R7150 是对照1,8K1180 是对照 2、6S0085是对照3、3S0057是对照4.利用XbaI、HindIII和BamHI对各系的DNA进行了 孟山都公司申请书_H7-1 128 酶切,并同标记cp4 epsps片段进行了杂交.如果T-DNA稳定地整合进入了植物基因 组,那么,被同一个限制酶降解的H7-1的所有后代应在电泳上显示出一个同样大小的 片段. 来自于H7-1后代的DNA(附图15),泳道3至6)产生了预期大小的片段:用BamHI降解的DNA产生了一个约为11.0kb大小的片段, 用XbaI降解产生了一个4.0kb大小 的片段, 用HindIII降解产生了一个5.2kb大小的片段.同样的降解产生的各种杂交片段, 除了是从不同后代产生的之外,在分子重量和迁移率上具一致性,证明T-DNA已经稳 定地整合进入植物基因组.非转基因对照系都没有产生同样的杂交谱带(附图15,泳道1、2、7和8).在H7-1转化体的诸多世代的电泳图谱特征,没有观察到任何的显著 差异.这些结果证明了不同世代间插入DNA的稳定性. 孟山都公司申请书_H7-1 129 3S0057 (nontransgenic line, single multigerm genotype) transformation and cloning 6401VH x CMS-MO females(1) multiplication crossing(2) under isolation, selection with glyphosate 64037G 64038G selfing(2) 64801H x CMS-MO females(1) 74906H 74908Hselfing(2) selfing(2) crossing(2) 74922H x CMS-MO females(1) 74901H x CMS-MO females(1) 74401G 74022G crossing(2) selfing(3) crossing(2) selfing(2) 84507G 83002S 74922H x CMS-MO females(1) 80501A, 80502A, 80503A 80504A, 80505A, 80506A crossing(3) 80507A selfing(2) 90106J, 90107J, 90539A 94901H 90540A, 90541A, 90542A 90543A, 90544A, 90545A 附图14. H7-1 选育是及其后代分离系谱 注: (1) 单胚甜菜材料(MO).细胞质雄性不育植物(CMS). (2) 分离后代.利用农达除草剂选择转基因植物. (3) 分离后代.利用PCR法,识别转基因植物. 孟山都公司申请书_H7-1 130 附表2. 转化体稳定性分析中应用的H7-1甜菜后代品系目录 H7-1转化体植株 (品系代号) 研究目的 6401VH, 64801H, 74901H, 74922H, 83002S 分子定性,遗传分离数据. 74022G 成份构成数据(1999* 田间试验),蛋白表达数据 (1999*). 80503A 成份构成数据(1999* 田间试验),蛋白表达数据 (1999*). 80502A, 80504A, 80505A, 80506A, 80507A 构成数据(1999),蛋白表达数据 (1999*),遗传分离数据 94901H, 90106J, 90107J, 90539A, 90540A, 90541A, 90542A, 90543A, 90544A, 90545A 遗传分离数据 注:* 表示进行研究的年份或者进行田间试验的年份. 孟山都公司申请书_H7-1 131 附表 3. 抗农达甜菜转化体 H7-1 不同世代分离模式 亲本 % 抗农达株2 Chi-square test 世代 供试品系 母本 1 父本 株数 观察值 期望值 Chi test value 显著性 3 备注 1 64037G 3A0047 MO 6401VH H7-1 62 51.6 50 0.10 NS 1 64038G 3A0064 MO 6401VH H7-1 44 63.6 50 7.40 * Few tested plants 5 1 64801H 6401VH H7-1 6401VH H7-1 77 67.5 75 3.00 NS 2 74022G 4E0006 MO 64801H H7-1 300 63.0 67 0.72 NS 2 74401G 4E0006 MO 64801H H7-1 400 65.3 67 0.13 NS 2 74901H 64801H H7-1 64801H H7-1 1052 84.1 87 0.74 NS 2 74906H 64801H H7-1 64801H H7-1 470 94.7 87 5.24 * Few pollinator plants 5 2 74908H 64801H H7-1 64801H H7-1 65 81.5 87 2.67 NS 2 74922H 64801H H7-1 64801H H7-1 2640 83.1 87 1.34 NS 2 74922H 64801H H7-1 64801H H7-1 7508 37.5 5 34 0.72 NS Homozygous plants selected by PCR 3 84507G 2A0011 MO 74901H H7-1 462 48.7 50 0.07 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80501A 6E0077 MO 74922H H7-1 460 65.2 67 0.15 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80502A 6A3971 MO 74922H H7-1 461 61.6 67 1.32 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80503A 6J0006 MO 74922H H7-1 460 65.7 67 0.08 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80504A 5J9101 MO 74922H H7-1 459 66.4 67 0.02 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80506A 7A3774 MO 74922H H7-1 459 59.1 67 2.82 NS Homozygous + Heterozygous H7-1 3 80507A 6A2695 MO 74922H H7-1 449 54.1 67 7.53 * Homozygous + Heterozygous H7-1 Timing of pollination5 续附表3. 抗农达甜菜转化体H7-1的世代分离模式 孟山都公司申请书_H7-1 132 亲本 % 抗农达株2 Chi-square test 世代 供试品系 母本 1 父本 株数 观察值 期望值 Chi test value 显著性 3 备注 4 94901H 74922H H7-1 74922H H7-1 616 76.3 4 75 0.09 NS After selection of heterozygous plants 4 90106J 6J0006 MO 74922H H7-1 616 53.1 50 0.38 NS 4 90107J 8J0029 MO 74922H H7-1 616 52.6 50 0.27 NS 4 90539A 6A3973 MO 74922H H7-1 616 55.2 50 1.08 NS 4 90540A 8A3871 MO 74922H H7-1 616 52.1 50 0.18 NS 4 90541A 8J0023 MO 74922H H7-1 616 51.3 50 0.07 NS 4 90542A 5J9101 MO 74922H H7-1 616 54.9 50 0.95 NS 4 90543A 6J0042 MO 74922H H7-1 616 47.7 50 0.21 NS 4 90544A 6E0076 MO 74922H H7-1 616 46.4 50 0.51 NS 4 90545A 7J0047 MO 74922H H7-1 616 49.5 50 0.01 NS 注: 1 MO: 单胚甜菜品系. 2 温室内用12 l/ha农达除草剂喷施,选择纯合及杂合抗农达植株 3 NS: 统计学差异不显著; *: 统计学差异显著,显著性水平 p=0.05 4 利用PCR分子标记选择纯合/杂合抗农达植株. 5 由于试验群体比较小,用于生产种子的授粉株也比较少以及授粉时间等因素存在,这些偏差是允许的.. 133 附图15. H7-1 转化体Southern blot 的分析: 世代稳定性分析 10 ?g转化体H7-1基因组DNA,最初转化体6401VH (H7-1 – 1995),三个后代64801H (H7-1 – 1996)、74922H (H7-1 – 1997)和83002S (H7-1 – 1998)]及非转基因对照DNA用BamHI, XbaI 和HindIII进行酶切.印迹斑用32 P标记的cp4 epsps探针(相当于PV- BVGT08质粒447bp-1555bp) 进行探测. XbaI HindIII neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker 234 545 7378 754 803 1050 1255 1416 1810 2319 2938 3609 5634 3988 14980bp 9007 4360 neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker neg.control 1 neg.control 2 neg.control 3 neg.control 4 H7-1-1995 H7-1-1998 H7-1-1997 H7-1-1996 Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI Unspecificbackgroundsignals BamHI unspecific background signals 孟山都公司申请书_H7-1 134 总之,针对H7-1转化体进行的各种观察与研究,包括Southern杂交分析和以表现型 观察为基础的分离数据,都是相互一致的,证明了cp4 epsps 基因按照孟德尔单基因遗 传方式遗传.用Southern杂交分析证实的插入片段的分子稳定性,已通过三代的结果得 到了证明.这些结果和上述的遗传稳定性数据以及分子生物学的分析结果相一致. 4. 转基因性状及产物的检测和鉴定技术 用特异性定性、定量PCR检测方法对H7-1抗草甘膦甜菜转化事件进行了检测鉴定. 这包括: - 抗草甘膦甜菜 H7-1 转化事件特异性定性 PCR 检测方法 - 抗草甘膦甜菜 H7-1 转化事件特异性定量 PCR 检测方法 5. 各试验阶段审批书的复印件(进口转基因生物直接申请安全证书的,本项不填写) 本申请为转基因生物直接申请进口用作加工原料的安全证书的续申请. 6. 各试验阶段的安全性评价试验总结报告(进口转基因生物直接申请安全证书的,本 项不填写) 本申请为转基因生物直接申请进口用作加工原料的安全证书的续申请. 7. 转基因植物对生态环境安全性的综合评价报告 转基因植物对生态环境安全性的综合评价报告请见下页. 8. 食品安全性的综合评价报告,包括: A)必要的动物毒理试验报告;B)食品过敏性 评价试验报告;C)与非转基因植物比较,其营养成份及抗营养因子分析报告等 食用安全性综合评价报告请见下页. 涉及商业保密资料,在本公开版本中已删除 孟山都公司申请书_H7-1 135 转cp4 epsps基因抗草甘膦甜菜H7-1环境和食用安全性 综合评价报告 一、摘要(转述转基因作物的遗传性状、试验年限、评价或检测指标及结论) 抗草甘膦甜菜H7-1是由美国孟山都公司和德国KWS SAAT AG(以下分别简称孟 山都和KWS)共同开发的产品.H7-1是通过农杆菌介导转化法,将来自土壤农杆菌 CP4菌株的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸转移酶(EPSPS)基因(cp4 epsps)导入受体甜菜得到 的.cp4 epsps基因可以编码对草甘膦不敏感的CP4 EPSPS蛋白,从而使转基因植物能耐 受农达类农用除草剂的有效成分草甘膦,为甜菜种植者提供简便的杂草控制途径. 抗草甘膦甜菜H7-1 的转化载体是PV-BVGT08 质粒(产品开发期又称为pMON17227),该质粒载体含有cp4 epsps基因表达盒,包括cp4 epsps编码序列及其调 控序列,利用农杆菌介导转化系统,将该表达盒导入甜菜,获得H7-1转化体.对H7-1 转化体进行的分子生物学特性分析证实,H7-1转化体在基因组内的单一插入位点含有 单一拷贝的插入片段.在甜菜基因组里,没有检测到质粒载体中与完整基因盒相接或 不相接任何其它的遗传元件,也不含有质粒骨架序列.此外,H7-1的插入序列以及表 达的草甘膦抗性可以在多个世代间稳定遗传. 针对抗草甘膦甜菜H7-1的食用安全评价包括:CP4 EPSPS蛋白特性、CP4 EPSPS的 生物信息学分析、H7-1甜菜生物学信息分析、甜菜地上部叶片和根的成分和抗营养因 子分析、CP4 EPSPS蛋白的模拟胃液消化研究、CP4 EPSPS蛋白急性经口毒性研究、大鼠90天喂养实验等.研究结果均表明,CP4 EPSPS蛋白与已知可能影响人类或动物健康 的致敏原、毒素和功能性蛋白之间均无显著序列相似性或同源性,对人和动物不具有 毒性(NOAEL至少为572 mg/kg体重),在模拟人类胃液条件下会很快消化(15秒内 有>95%会被降解消化),组成成分和抗营养因子方面实质等同于对照和常规甜菜,90 天大鼠喂养实验也未发现异常.因此,H7-1不会对人类和动物健康不利影响. 于1998-1999年在欧洲进行了大田和温室试验,对抗草甘膦H7-1甜菜和非转基因甜 菜品系的营养生长和生殖生长形态和发育性状进行了考察,对于生存竞争能力进行了 评价.结果表明抗草甘膦品系H7-1与非转基因品系之间在形态、发育和花序相关的性 状上不存在生物学意义上的差异,不会改变受体甜菜的生存竞争能力.1998-2001年在 美国进行了大量的田间试验,考察了抗草甘膦H7-1转化体与对照对病虫害的易感性和 与环境的互作影响,以评估H7-1甜菜对环境的潜在影响.测结果表明,抗草甘膦甜菜 H7-1与对照的病虫害易感性没有生物学意义上的差异,证明抗草甘膦性状的引入没有 改变植物-病虫害互作影响.支持H7-1环境安全性的结论. 2000和2001年生长季在美国明尼苏达州(MN)和北达科他州(ND)典型甜菜种 植区的9个试点进行了H7-1甜菜的田间试验.这些田间试验中,将H7-1甜菜与常规甜菜 进行了比较,包括常规对照和已商业化的甜菜产品.这些试验研究评估了H7-1甜菜的 农艺性状和表型特征以及对病害虫害的敏感程度,以确定植株的性状特性及其与环境 的互作,从而评估H7-1甜菜与对照品系相比其演变成有害植物的可能性和杂草化潜 势.基于所调查的各类作物特征,评估结果表明,与常规甜菜相比,H7-1甜菜没有任 何与增加杂草化潜势或增加对环境不利影响相关的表型相关变化或是对虫害病害敏感 性改变. 在中国境内的食用安全性评价于2007~2008年完成,其中由中国疾病预防与控制中 心营养与食品安全所进行了90天大鼠喂养实验,由农业部农产品质量监督检测测试中 孟山都公司申请书_H7-1 136 心(北京)暨中国农业大学食品科学与营养工程学院对H7-1及对照的加工干甜菜浆的 营养成分和抗营养成分进行了分析,结果证实了抗草甘膦甜菜的食用及饲用安全性. 二、背景介绍 甜菜是主要的糖料作物之一,甜菜根是主要的收获器官,用于榨糖业.主要加工 产品是糖,用于当地食品加工行业或出口. 抗草甘膦甜菜H7-1是由美国孟山都公司和德国KWS SAAT AG(以下分别简称孟 山都和KWS)共同研发的产品.按照农业部任务下达要求,2007~2008年间,中国疾病 预防与控制中心营养与食品安全所进行了90天大鼠喂养实验,农业部农产品质量监督 检测测试中心(北京)暨中国农业大学食品科学与营养工程学院对H7-1及对照的加工 干甜菜浆的营养成分和抗营养成分进行了分析.结果证实了抗草甘膦甜菜与常规对照 一样安全. H7-1甜菜的转化过程如下: 农杆菌CP4株系 含cp4 epsps基因甜菜植株再生,转化体命名为H7-1 草甘膦筛选含有cp4 epsps基因的转化细胞 利用农杆菌介导转化系统转化甜菜品系3S0057 组装PV-BVGT08质粒载体 甜菜H7-1植株田间农艺性状评价 cp4 epsps 基因盒 甜菜H7-1转化体植株评价 抗农达甜菜H7-1 孟山都公司申请书_H7-1 137 三、受体生物学特性 受体甜菜在分类学上属于绿色植物门(Chlorophyta)、维管束植物亚门( Tracheophyta)、被子植物纲(Angiospermae)、双子叶植物亚纲(Dicotyledoneae)、 藜目(Chenopodiales)、藜科(Chenopodiaceae)、甜菜亚科(Betoideae)、甜菜族( Beteae)、甜菜属(Bata). 绿色植物门(Chlorophyta) 维管束植物亚门(Tracheophyta) 被子植物纲(Angiospermae) 双子叶植物亚纲(Dicotyledoneae) 藜目(Chenopodiales) 藜科(Chenopodiaceae) 甜菜亚科(Betoideae) 甜菜族(Beteae) 甜菜属(Bata) 甜菜是一种二年生植物,生长的第一年长出粗壮的多汁根,第二年长出种子茎. 一般甜菜根植物是在春天种植,并在当年的秋天收获.但若要收获甜菜种子的话,植 物需要越冬生长植根,再生长的过程. 甜菜的原产地是欧洲,也有人认为甜菜原产于底格拉斯河和幼发拉底河流域. 2011年,世界甜菜生产产量最大的前五名国家是:法国、美国、德国、俄罗斯和乌克 兰. 美国商品甜菜只种植一年,目的是收获根而不是像玉米和大豆那样收获种子.收 获的甜菜根也不用于出口,而是在本地加工成食用糖或饲用甜菜浆和糖蜜.大约1896 年甜菜被引入我国. 甜菜是我国主要的糖料作物之一,常年播种面积在30万至40万公顷.甜菜具有耐 低温、抗逆性强、适应性广的特点,主要分布于北纬40度以上的东北、华北和西北三 大地区.东北产区包括松辽平原、三江平原.即黑龙江省、吉林省、辽宁省以及内蒙 古自治区东部.该产区属温带大陆性气候,冬季长、干燥寒冷,春秋季节短促,夏季 高温多湿,年平均温度5.4度.华北地区包括内蒙古西部、山西北部和河北北部,气候 特点是冬季干燥、夏季炎热、昼夜温差大.西北甜菜区主要包括新疆、甘肃的河西走 廊、宁夏的黄灌区,该区地处高原,属温带大陆性气候,为干旱半干旱地区或荒漠地 区,冬季干燥寒冷,春季短促,夏季炎热. 抗草甘膦甜菜H7-1的受体为KWS 公司拥有知识产权的多心皮甜菜品系3S0057. 四、基因操作 使用历史上已经被广泛地应用和接受(Howard, 1990)的农杆菌转化技术,用含有 PV-BVGT08质粒(含有cp4 epsps基因)的农杆菌CP4转化甜菜3S0057 (KWS SAAT AG公司所有),通过筛选那些抗草甘膦的转化体,多次自交,考察转化体的生物学和 农艺学特性,得到了能稳定表达CP4 EPSPS蛋白的H7-1. 分子生物学分析证明,H7-1中的插入序列包含有cp4 epsps基因表达盒,大小约为 3.4 kb,为单一插入位点单拷贝插入.该插入序列包括以下遗传元件:目的基因cp4 epsps:大小1368 bp,该基因来自土壤农杆菌CP4菌株,编码CP4 EPSPS蛋白(CP4 5-烯 孟山都公司申请书_H7-1 138 醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸转移酶),使植物耐受草甘膦类除草剂的伤害.启动子为 FMV,玄参花叶病毒35S修饰启动子.终止子为E9,豌豆核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小 亚基(RbcS2)E9基因的3'端非转录序列.此外,插入序列还包括来自拟南芥的叶绿体 转移肽序列(CTP2). H7-1含有完整的插入序列,不含有任何报告基因和标记基因序列,也不含质粒骨架 序列. H7-1甜菜是采用农杆菌介导转化法将PV-BVBG08质粒载体(见下图)含有左、右 边界内的T-DNA导入到3S0057受体,并进一步筛选、评价培育而成的. PV-BVGT08质粒图谱,用于转化H7-1 五、遗传稳定性 利用酶联免疫吸收分析法(ELISA)测定了H7-1地上部叶片和根组织中的CP4 EPSPS蛋白的水平.1999年在欧洲5个不同田间试验点地上部叶片和根中的平均表达含 量分别为172 ?g/g鲜重和168 ?g/g鲜重;2003年在美国5个不同田间试验点地上部叶片和 根中的平均表达含量分别120 ?g/g鲜重和100 ?g/g鲜重.这些结果表明了目的基因在不 同年度、不同地域间的蛋白表达量基本是稳定的. 为了证明H7-1插入片段在育种过程中的稳定性,对H7-1及其3个后代品系基因组 DNA进行Southern杂交分析,以确定插入片段的整合稳定性.结果表明H7-1及三个后代 品系均产生了预期大小的杂交片段,杂交信号的分子量和迁移率是一致的,而非转基 因对照品系没有产生杂交信号.这些结果表明插入序列稳定插入甜菜基因组,在供试 的3个世代间稳定遗传. PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border ori-V rop ori-322 aad Right Border P-FMV ClaI 2406 XhoI 2389 NotI 2380 PstI 2368 BamHI 1702 KpnI 1700 SacI 1694 EcoRI 1684 SacI 1680 PstI 1151 PstI 6540 PstI 7479 HindIII 7972 SacI 7982 EcoRI 8102 EcoRI 8505 XbaI 8571 BglII 8577 HindIII 8583 ClaI 8590 HindIII 5 KpnI 814 PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border PV-BVGT08 ctp2 cp4 epsps E9 3' Left Border ori-V rop ori-322 aad Right Border P-FMV ClaI 2406 XhoI 2389 NotI 2380 PstI 2368 BamHI 1702 KpnI 1700 SacI 1694 EcoRI 1684 SacI 1680 PstI 1151 PstI 6540 PstI 7479 HindIII 7972 SacI 7982 EcoRI 8102 EcoRI 8505 XbaI 8571 BglII 8577 HindIII 8583 ClaI 8590 HindIII 5 KpnI 814 孟山都公司申请书_H7-1 139 对H7-1转化体育种的四个世代,通过喷施草甘膦除草剂,调查并分析了不同遗传世 代的抗草甘膦表现型遗传分离的数据,采用卡方测验(Chi-square analysis)的方法,比 较了不同世代植株表现型分离比例与理论分离比例的一致性,并且可以稳定遗传.根 据孟德尔遗传学,从另外角度证明cp4 epsps基因表达盒插入到单个染色体的单个基因 座位上. 六、环境安全评价 生存竞争能力:为了考察转基因抗草甘膦品系H7-1生长发育的等同性和适应性, KWS公司于1998-1999年在田间和温室条件下,对抗草甘膦H7-1甜菜和非转基因甜菜品 系的营养生长和生殖生长形态和发育性状进行了考察.考察的性状包括:花粉生产力 (花药数目、每枚花药的花粉粒数、花粉萌发率、花粉管长度),是否对植株的散布 和生存能力有影响;每个子房的胚珠数及其大小对种子的发芽势具有影响,进而影响 种子材料的适应性;植株的生产力相关的种子和种子质量方面的差异;发育周期(通 过抽苔/开花和收获期来考察)和分枝的数目、种子发芽率、千粒重、种子休眠和春化 所需日数均对生存竞争能力都可能有影响.研究表明,抗草甘膦甜菜H7-1与非转基因 品系之间在形态、发育和花序相关的性状上不存在生物学意义上的差异.而且,H7-1 记载的所有性状均处于常用的的二倍体、多心皮和单心皮甜菜育种品系的正常范围之 内.因此,H7-1与非转基因甜菜品系在适应性方面相似,没有生物学意义上生存竞争 能力上的差异. 生物多样性:1998-2002年在按照美国USDA的批准对H7-1甜菜进行了田间监测, 考察了抗草甘膦H7-1转化体与对照对病虫害的易感性和与环境的互作影响.结果表明 共4个生长季节98个试验中,只有6个试验中检测到病害感染差异.其中有3个试验点 中,与对照相比,H7-1甜菜提高了对白粉病的抗性;而在其它3个试验点中,H7-1与对 照对白粉病的感染程度正相反.说明上述检测到病害差异不具有一致趋势.而在98个 试验中,H7-1与对照间没有发现害虫和线虫的危害差异.说明H7-1不具有转变为有害 生物的潜势.总之,美国连续4年的田间试验监测结果表明,抗草甘膦甜菜H7-1与对照 的病虫害易感性没有生物学意义上的差异,证明抗草甘膦性状的引入没有改变植物-病 虫害互作影响,除了为种植者提供便捷的杂草控制方式以外,抗草甘膦甜菜不会改变 常规甜菜育种和生产方式(美国农业部http://www.aphis.usda.gov/biotechnology/not_reg.html). 基因飘移:糖用甜菜主要通过风媒传粉和有限的虫媒传粉.在授粉期间,甜菜被 认为是强烈的自花不亲和性植物,这是由于其柱头在花开时尚未完全成熟,因此需要 同其它甜菜或者甜菜属的其它物种的植株进行异花授粉才能产生种子. 糖甜菜能同甜菜属的其它成员,包括野生亲缘种自由杂交,能和糖甜菜杂交的野生 近缘种很少.而且糖甜菜种植的目的是收获营养块根,所以,从遗传学角度来说,糖 甜菜生产中发生花粉调节的基因漂移的可能性非常低.而甜菜商业化种子生产中采取 的严格的隔离措施、地理条件选择,也会避免种子生产过程中基因漂移的发生. 七、食用安全评价 营养学评价:1999年在欧洲6个田间试验点(英国、法国、西班牙、意大利、德国 和比利时)采集H7-1及其非转基因对照甜菜的地上部叶片和根组织,测定了25项成分 和抗营养成分的含量(18个氨基酸;6个营养成分和一个皂角苷抗营养成分)在H7-1甜 菜和对照间共进行了55项统计学比较,发现其中七项对比在p<0.05水平上具有统计学差 异.但是,转化体H7-1与对照相比,具有统计学差异的检测值,都在非转基因对照和 孟山都公司申请书_H7-1 140 商用参照品种的观察值域内,也在商用甜菜品种现有公开的成分含量值域内.因此检 测数据属于甜菜自然变异范围.这些结果证明,转化体H7-1与非转基因对照和其它商 用甜菜品种在地上部叶和甜菜根组织的关键营养元素和其它重要营养成分的水平上, 具有实质等同性. 2007-2008年由农业部农产品质量监督检测测试中心(北京)暨中国农业大学食品 科学与营养工程学院对H7-1及对照的加工干甜菜浆的营养成分和抗营养成分进行了分 析,证实了抗草甘膦甜菜和非转基因对照在组成成分上的实质等同性. 毒理学评价:供体生物农杆菌CP4菌株具有长期安全应用的历史,目前没有致病性 的报道.利用毒素数据库进行CP4 EPSPS蛋白的生物信息学分析表明,该蛋白和已知能 在人体和动物体内引起不良反应毒素蛋白和其它具有生物学活性蛋白都没有结构和序 列上的相似性. 采用单一剂量CP4 EPSPS蛋白进行了小鼠急性经口毒性研究.口服饲喂CP4 EPSPS 蛋白高达572 mg/kg没有在小鼠上产生任何与处理相关的不利效应,实验中没有发现 CP4 EPSPS蛋白处理对于小鼠的存活率、临床表现、增重、饲料消耗或总的病理学观察 有什么不利影响.因此,可以推断CP4 EPSPS的"未观察到有不良作用剂量水平" (NOAEL)至少为572 mg/kg体重. 为了评价抗草甘膦甜菜对人类和动物健康的潜在影响,利用抗草甘膦甜菜H7-1加 工的甜菜浆(以下称为测试材料)饲喂Sprague-Dawley 雌雄大鼠,饲料中的掺入比例 为2%和5%(w/w).常规对照品种加工的甜菜浆(以下称为对照材料)按大约5% (w/w)的比例加入鼠粮,在相似的条件下喂养大鼠至少90天.每组实验动物包括20只 雄鼠和20只雌鼠.没有观察到与测试材料相关的临床发现.体重、血清化学和尿检参 数没有受到测试材料饲喂的影响.没有发现测试材料对食物消耗量、血液学参数或器 官重量有影响.饲喂测试材料大鼠的观察值处于饲喂含参考对照甜菜浆饲料老鼠的观 察值范围内.组织的肉眼检查和显微检查没有看到测试物相关的发现.大鼠喂养实验 说明,用含5%抗草甘膦甜菜H7-1加工甜菜浆的鼠粮连续饲喂老鼠13周,没有对老鼠的 生长、健康或行为产生不利影响. 中国疾病预防控制中心食品与营养安全所受农业部委托,利用孟山都公司提供的抗 除草剂甜菜H7-1及其对照甜菜根加工的干甜菜浆进行了90天大鼠喂养实验.干甜菜浆 按2. 5% 、5 .0% 、1 0.0% 比例掺入基础饲料,饲喂大鼠90天,动物活动、生长未见异 常, 被毛浓密有光泽.抗除草剂甜菜H7 - 1 干甜菜浆组与亲本甜菜浆组和基础饲料组 比较, 未发现抗除草剂甜菜H7-l干甜菜浆对实验大鼠体重、食物利用率、血液学指 标、血生化指标、脏体比以及组织病理学观察有生物学意义的改变. 致敏性评价:评价一个蛋白质是否是过敏原或可能含有交互反应结构的一个有效 的方法,是将其与已知的过敏原比较氨基酸序列.CP4 EPSPS来自农杆菌CP4菌株,该 供体生物为非致敏原;利用最新的致敏原数据库进行的CP4 EPSPS蛋白信息学分析没有 发现CP4 EPSPS蛋白氨基酸序列同已知的致敏原、醇溶蛋白或者谷蛋白氨基酸序列之间 具有结构和序列相似性. 利用FASTA序列分析软件为工具进行生物信息学分析(Pearson and Lipman, 1988),比较了CP4 EPSPS 蛋白与AD4过敏源数据库里各种蛋白结构的相似性,以评 价该蛋白不是过敏源,并且与已知过敏源是否有交叉反应(附件4),并依据CP4 EPSPS 蛋白与过敏原 蛋白的相 似性进行了排序. 其中相似程度最高 的为尘螨孟山都公司申请书_H7-1 141 (Dermatophagoidesfarinae)过敏原Der f 2(登记号AAB330829),其中在1个82个 氨基酸长度的片段上其同源性为30.5%,F值为0.41.如果在CP4 EPSPS全长序列(455 个氨基酸)上进行比较,重叠的序列相对很少(18%).因此可以推测CP4 EPSPS 蛋 白和 Der f 2过敏原没有结构和功能上的同源性.由于氨基酸一致性序列至少超过整个 蛋白质全长的50%以上时才可能存在过敏交叉反应 (Aalberse, 2000),因此CP4 EPSPS蛋 白和Der f 2过敏原极不可能存在交叉反应.其余的比较分析结果表明,CP4 EPSPS蛋白 和其它致敏源之间没有显著的相似性. 造成某些食物蛋白质过敏性的另一个重要的因子,是它们在食物中的高含量 (Taylor 等,1987;Taylor,1992;Fuchs 和Astwood,1996).多数过敏原在特定的食 物中都是作为主要的蛋白质成分存在的,表现为从全部蛋白质的2-3%到80%(Fuchs 和Astwood,1996).而CP4 EPSPS 蛋白质在甜菜H7-1中表达水平很低,大约只占总鲜重 的0.02%,对人类健康的影响很小. 另外,Harrison等人(1996)证明了CP4 EPSPS蛋白能在模拟胃液里迅速降解.根 据蛋白质印迹杂交分析,CP4 EPSPS在胃消化系统的半衰期不到15秒钟,在肠消化系统 里不到10分钟.因此,即使任何的CP4 EPSPS蛋白可以坚持进入胃消化系统中的话,也 势必会迅速降解掉. 随后进行的CP4 EPSPS蛋白离体模拟胃液(SGF)消化试验也证实了上述观点 (附件9),该试验采用国际生命科学研究所(ILSI)公布的标准方法(Thomas et al., 2004).同Harrison等人(1996)以前的试验一样,本项研究也采用了大肠杆菌生产的 CP4 EPSPS蛋白,消化率采用SDS-PAGE凝胶染色(colloidal blue staining)、蛋白质印 迹杂交(Western blot)和CP4 EPSPS酶活性鉴定进行评估. CP4 EPSPS蛋白在模拟胃液内能迅速被消化,95%以上的CP4 EPSPS蛋白在15秒钟 内被消化,说明CP4 EPSPS蛋白能在模拟胃液里迅速降解,所以不可能对人体健康产生 危险;温度高于55o C热处理CP4 EPSPS蛋白,可以使蛋白功能活性降到检测限以下,说 明加热处理后,CP4 EPSPS蛋白的功能活性具有降低趋势.上述这些分析结果表明CP4 EPSPS蛋白不具有致敏性. 抗生素抗性:H7-1不含任何抗生素抗性标记基因.在基因操作时用于筛选质粒的 aadA抗生素抗性标记基因和其它骨架序列都没有整合到H7-1的基因组中.因此H7-1不 具抗生素抗性. 八、非预期效应 H7-1在欧洲和美国进行了大量的环境安全、食用安全评价试验.H7-1已经在2005 年分别在美国和加拿大批准了商业化.并在包括中国在内的11个国家和地区获得了作 为加工原料的进口批准,主要进口糖及甜菜和糖蜜等加工副产品.结果均表明H7-1是 安全的,未发现非预期效应.在中国境内的食用安全检测结果也是如此,未发现非预 期效应. 九、生产应用前景及拟采取的安全监控措施 美国孟山都公司和德国KWS SAAT AG(简称KWS)共同开发的抗草甘膦甜菜H7- 1,可以表达对草甘膦不敏感的CP4 EPSPS蛋白,从而使转基因植物能耐受农达类农用 除草剂的有效成分草甘膦,为甜菜种植者提供简便的杂草控制途径.H7-1已经获得美 国和加拿大的商业化种植批准.此外,在中国、澳大利亚、新西兰、哥伦比亚、欧 孟山都公司申请书_H7-1 142 盟、日本、韩国、菲律宾、新加坡、墨西哥和俄罗斯等11个国家和地区获得进口审 批. 孟山都公司在中国申请H7-1转基因安全证书的目的是进口糖或榨糖副产品,用作 食品或饲料行业的加工原料.从而中国的消费者也可以从产品的商业化种植获益. 需要说明的是,中国自美国进口的甜菜产品主要是压榨糖,不具有活性,并且进 口量非常低,仅占美国糖出口量的0.2-0.3%(USDA),这些糖包括甜菜糖和甘蔗糖, 并且糖中基本不含转基因成分.因此中国由于进口糖所导致的转基因逃逸的风险几乎 不存在.假定将来甜菜贸易量增加,进口的产品除了糖以外,还包括含有转基因成分 的榨糖副产品,如:糖蜜或糖浆,那么孟山都公司和KWS公司会按照既定的规程、措施,对贸易商的进口活动进行跟踪和监控.在其它大宗进口作物如:大豆、玉米、油 菜等产品的实践经验证明,这些监控措施是安全有效的. 作为产品研发商,孟山都公司和KWS SAAT AG公司会要求贸易商采取措施,严 格遵守相关法律法规,包装运输要可靠,标识要清楚,运输各环节严格操作,必要时 向贸易商提供技术指导和支持,以保证H7-1甜菜的贸易符合农业部颁发的安全证书的 要求. 十、结论 大量的研究结果表明,自甜菜H7-1在2005年分别在美国和加拿大批准商业化以 来,抗草甘膦甜菜H7-1对人类健康和环境、食用方面的安全没有负面影响,与受体和 常规甜菜品种实质等同. 孟山都公司申请书_H7-1 143 9. 该类转基因植物国内外生产应用概况 甜菜工业起源于欧洲.1813年,法国是世界上最大的甜菜生产国,自此至今,法 国一直保持其世界生产量第一的位置. 美国55%的加工糖制品来源于甜菜,由甜菜来源的糖被加工成精制糖作为食品,加 工的糖蜜和糖浆用于饲料.美国是世界上最大的糖生产国和消费国,由甜菜加工的糖 制品约有3%用于出口. 孟山都公司和KWS SAAT AG公司共同研发了抗除草剂甜菜产品H7-1, 于2004年获 得美国食品与药品管理局(FDA)食用和饲用的批准,2005年获得美国农业部 (USDS-APHIS)和加拿大卫生部(HC)及加拿大食品安全监管署(CFIA)的商业化 种植批准.此外,抗草甘膦甜菜H7-1在多个国家和地区获得了作为加工原料的进口批 准,主要进口糖及甜菜和糖蜜等加工副产品.这些进口批准国家包括澳大利亚、新西 兰、哥伦比亚、欧盟、日本、韩国、菲律宾、新加坡、墨西哥和俄罗斯.研究和试验 以及目前在生产应用过程中未发现对人类健康和环境产生不利影响. 按照相关法律法规的要求,孟山都远东有限公司2005年首次向农业部转基因生物 安全管理办公室提交了《转cp4 epsps基因抗草甘膦甜菜H7-1作为加工原料进口的安全 证书》,并按照批准在中国境内由农业部指定检测机构完成了食用安全性检测. 自商业化至今,还没发现H7-1的应用会对人类健康和生态环境带来的不利影响. 本申请书的第六部分关于"应用前景及拟采取的安全监控措施"也对H7-1自商业化以 来在国内外生产应用的情况进行了叙述. 10. 田间监控方案,包括监控技术、抗性治理措施、长期环境效应的研究 方法等 本申请书为获得抗除草剂甜菜H7-1进口用作加工原料的安全证书,不会在中国境 内种植. 获得H7-1进口安全证书以后,孟山都公司会按照相关的法律法规和农业部批准的 安全证书上的要求严格使用和管理安全证书,并明确要求贸易商清楚了解批准的安全 证书应用范围和有效期,要求贸易商在有效期范围内向孟山都公司申请H7-1进口安全 证书的复印件.孟山都公司对贸易商在安全证书使用上的要求将包括: 1、要求贸易商必须持有相应转化事件的进口安全证书才能进口含有相应转化事件的商 品. 2、孟山都公司提供的安全证书复印件只供申请的贸易商自用或其拥有或控制的子 公司使用. 3、贸易商必须同意只按照安全证书的批准范围使用安全证书,不得将其复印件提 供给任何第三方. 4、贸易商在使用安全证书进行交易时必须严格遵守相关的法律和法规. 5、所提供的安全证书只允许作为加工原料用于食用及饲用的原料的进口,不支持 作为遗传研究或种植的材料进口.贸易商必须同意采取必要合理的安全控制手 孟山都公司申请书_H7-1 144 段,以保证进口原料不会被释放到环境中或者被用于可能对生物多样性、可持 续利用或人类健康存在潜在风险的用途. 6、如果贸易商没有按照规定使用安全证书,孟山都公司保留收回安全证书使用权的权 力. 除了在安全证书使用上对贸易商提出明确要求外,孟山都公司还会详细记录并保存 所有申请过安全证书复印件的贸易商信息,包括公司名称、地址、联系人、联系电话 和电子邮箱地址,以便更好的对使用孟山都公司安全证书的贸易商进行监督.此外, 孟山都公司还会就包装/标识和运输环节,对从事转基因产品贸易的贸易商提出要求, 并不定期的回访贸易商,对进口产品进行监督,如发现任何违规操作或意外事件发 生,立即向当地的农业行政主管部门和农业部报告.在必要时,孟山都公司也会向贸 易商提供技术指导和支持. 11. 审查所需的其它相关资料 对H7-1甜菜在国外进行了全面的安全性评价研究,包括全面的分子生物学特性、 新引进蛋白的生化特性、环境安全性评价以及食用安全性评价研究,按照农业部的任 务下达要求,有国内转基因生物食用安全检测机构对H7-1进行的食用安全性检测,所 有研究表明:H7-1对人类、动植物和生态环境不会产生不利影响.为保持申请书的完 整性和便于审阅,所有技术报告附在申请书正文之后.所以技术研究报告为商业保密 信息,因此公开版本只包括申请书正文部分. 12. 转基因生物在输出国家或地区已经允许作为相应用途并投放市场的证 明文件 H7-1甜菜已经获得美国食品与药品管理局和美国农业部的批准,在美国商业化种 植.批准文件如下. ? 2004 年美国食品与药品管理局(FDA)批准文件翻译和英文复印件 ? 2005年美国农业部(USDA/AHPIS)的批准文件翻译和英文复印件 孟山都公司申请书_H7-1 145 卫生与人类服务部 公共卫生服务 联邦食品与药品管理局 College Park 20740 Aug 17, 2004 Ronald Schneider Monsanto Company; E3NB 800 N. Lindbergh Blvd St Louis, MO 63167 尊敬的Schneider先生: 此信是对孟山都公司及KWS SAAT AG( KWS) 公司关于遗传改良抗草甘磷H7-1 甜 菜寻求 FDA 咨询的回复, 根据孟山都公司和KWS公司的资料,抗草甘膦H7-1 甜菜编 码合成CP4 5-烯酰丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4 EPSPS),具有抵御除草剂草甘磷能 力.所有关于此项申请的材料均归档在BNF0090,这些资料将由食品添加安全办公室 管理. 孟山都公司以及KWS 公司于2003年4月16日向食品与药品管理局提交了抗草甘膦 甜菜H7-1在安全及营养评估方面的总结性材料.孟山都及KWS 公司还于在2003年12月 4日提供了补充材料,我们理解孟山都公司及KWS公司所做的这些沟通并通知FDA都是 为确保此产品遵循联邦食品,药品及化妆品的有关法律.同时我们也认为根据孟山都 公司和KWS 公司所进行的安全及营养评估,你们得出的结论是抗草甘膦甜菜H7-1在在 产品组成上,安全以及其他相关要素方面和市场上销售的常规甜菜(用于加工的茎 块)没有实质性的不同,因此不需要进行市场准入前的复审及批准. 孟山都公司和KWS 公司在上市来源于H7-1 的食品和饲料等产品之前,还需要获得 其他相关部门如美国农业部、美国环保局的批准. 根据这次咨询的有关数据的描述及提供的信息,我们没有其他意见,但是孟山都 公司和KWS 公司有责任来保证此产品在市场上是安全的,有益健康的并遵循其他相关 的法律与法规. 你忠诚的 Laura M. Tarantino 博士 主任 市场准入批准办公室 食品安全与应用 营养中心 孟山都公司申请书_H7-1 146 孟山都公司申请书_H7-1 147 关于孟山都公司寻求(03-323-01P)对抗草甘膦甜菜品种 H7-1 非管制地位认定的批复 无明显影响的判定 2005年2月 美国农业部(USDA)动植物卫生检疫局(APHIS)按APHIS的7 CFR之340 条款的规定,在批准孟山都公司和KWS 公司申请转基因甜菜H7-1 ( OECD 唯一 号: KM-000H71-4) 非管制地位认定之前,已经进行了环境评估(EA).该申 请的主题是表达耐草甘膦除草剂的5-烯醇丙酮芥草酸盐-3-磷酸合成酶(EPSPS) 的转基因工程的甜菜.根据该EA中的分析和我们对这些评价的回答, APHIS认 为转基因甜菜品种 H7-1及其后代对环境没有明显影响的判断(FONSI). Cindy Smith 副局长 动植物卫生检疫局 美国农业部 2005年3月4日 孟山都公司申请书_H7-1 148 孟山都公司申请书_H7-1 149 孟山都公司申请书_H7-1 150 12. 输出国家或地区经过科学试验证明对人类、动植物和生态环境无害的 资料(境内单位申请安全证书的,本项不填写) (技术报告为商业保密资料,单独装订) 报告 编号 技术报告标题 报告1 抗农达甜菜H7-1的分子生物学特征(PLT6016-1MA) 报告2 1999年在欧洲田间试验中抗农达甜菜H7-1地上部叶片和根部组织中CP4 EPSPS蛋白组 织表达水平的评价(Monsanto Study Report, MSL-17007) 报告3 1998-1999年德国田间试验中抗农达甜菜H7-1及常规对照品系生长发育及表现型和发 育观察结果——实质等同性评估(KWS Study Report, KWS 6016-1) 报告4 利用AD4、TOXIN5和ALLPEPTIDES数据库进行CP4 EPSPS蛋白的生物信息学分析 (Monsanto Study Report, MSL-18752) 报告5 CP4 EPSPS蛋白的小鼠急性口服毒性试验(Monsanto Study Report, MSL-13077) 报告6 H7-1和大肠杆菌生产的CP4 EPSPS蛋白理化性质和功能等同性评价 报告7 抗农达转化体H7-1甜菜浆 90天大鼠喂养试验(Monsanto Study Report, MSL-18820) 报告8 转基因甜菜H7-1的90天大鼠喂养试验(中国疾病预防控制中心检测报告) 报告9 大肠杆菌纯化的CP4 EPSPS蛋白在模拟胃液中离体消化分析(Monsanto Study Report, MSL-17566) 报告10 1999年在欧洲田间试验中抗农达甜菜H7-1及非转基因对照品系地上部叶片和根部组织 营养成分分析(Monsanto Study Report, AGREN 27.10.99) 报告11 世界经合组织关于甜菜新品系营养成分考虑的一致性文件——食用饲用营养成分和抗 营养因子(OECD: http://www.olis.oecd.org/olis/2002doc.nsf/LinkTo/env-jm- mono(2002)4) 报告12 转基因抗农达甜菜H7-1食用安全性综合评价报告(中国疾病预防控制中心) 报告13 抗农达甜菜H7-1基因插入位点的旁侧序列确定(PLT6016-4MA) 报告14 抗农达甜菜H7-1的特异性定性PCR检测方法(PLT6016-2MA) 报告15 抗农达甜菜H7-1的特异性定量PCR检测方法 报告16 转基因甜菜H7-1干甜菜浆抗营养因子皂角苷含量检测报告(农业部转基因生物食用 安全监督检验测试中心(北京)) 报告17 转基因甜菜H7-1干甜菜浆全组分检测报告(农业部转基因生物食用安全监督检验测试 中心(北京)) 孟山都公司申请书_H7-1 151 七、本单位农业转基因生物安全小组审查意见 抗农达甜菜H7-1 (也称为抗草甘膦甜菜H7-1)已经通过了美国农业部、美国食品 与药物管理局的相关审定包括用作食品、饲料,因此可以自由进口进入美国市场、种 植及相关贸易. 大量试验包括食品、饲料及环境安全评估证明抗农达甜菜 H7-1 是安全的,理由 是: ? 研究开发抗草甘膦甜菜H7-1遗传转化过程中采用的遗传元件是安全的; ? 对插入DNA的详细分子特性鉴定表明,插入DNA 是在单一位点单拷贝插入; ? 从CP4 EPSPS蛋白质安全应用历史资料表明,CP4 EPSPS是安全的; ? 从CP4 EPSPS蛋白质没有毒性及致敏性; ? 抗草甘膦甜菜H7-1和亲本及常规甜菜在组成上、营养成份(营养物质、抗营养因 子、过敏原)等具有实质等同性; ? 抗草甘膦甜菜H7-1 在农艺性状上和亲本及常规甜菜没有区别. 根据所有这些内容的评估,抗农达甜菜H7-1 和其它甜菜一样,在食用及环境影响 方面,与常规甜菜一样安全. 根据《农业转基因生物安全管理条例》及其它相关法规的规定,同意上报该申 请. 小组组长(签章) 2009年2月20日 孟山都公司申请书_H7-1 152 八、 本单位审查意见 孟山都公司和KWS公司利用现代生物技术,共同开发了抗草甘膦转基因甜菜H7- 1,转基因甜菜能够耐受草甘膦除草剂.作为甜菜综合防除杂草的一部分,抗草甘膦甜 菜为农户提供简便、安全的杂草控制方式. 由于抗草甘膦除草剂在防除一年生和多年生杂草的高效活性,种植H7-1甜菜可以 节约成本,降低除草剂使用次数,给农民带来经济效益.抗草甘膦甜菜的种植同时可 以促进免耕技术的推广应用,从而可以防止水土流失、改良土壤结构、增加土壤有机 质含量及减少二氧化碳的排放,具有环境效益. 抗除草剂甜菜H7-1由农业部指定检测机构完成了食用安全性检测,根据农业转基 因生物安全管理相关法规要求,同意上报进口用作加工原料的安全证书. 单位公章 负责人(签章) 2009年2月20日 孟山都公司申请书_H7-1 153 九、所在省(市、自治区)的农业行政主管部门的审查意见 (进口转基因生物直接申请安全证书的,本项不填写) 单位公章 负责人(签章) 日期: 年月日