· 实用临床免疫学· ABO 血型基因分型及应用 兰炯采 孟庆宝 张印则 周华发 王从容 曹琼(第一军医大学南方医院输血科 ,广州 510515) 刘忠(合肥血液中心 ,合肥 230022) 中国图书分类号 R45711 + 文献标识码 A 文章编号 10002484X( 2002) 0620430204 摘要目的 :研究 ABO 血型基因分型的意义.方法 :采用聚合酶链反应2序列特异性引物 (PCR2SSP) 基因定型方法对 ABO 血型基因定型并观察其基因多态性分布特征和疑难血型检定.结果 :对已知 ABO 基因的 DNA 标本进行基因定型 ,证实 文中的 ABO 基因定型方法可靠 ;对104 例健康、 无血源关系的汉族个体 ABO 血型基因定型 ,结果与血清学所定表型完全符合 ; 并用 ABO 基因分型技术解决临床输血前血型鉴定、 产前胎儿血型鉴定、 亲权试验及血清学亚型的正确性验证.结论 :ABO 血 型基因分型技术可以正确判定 ABO 血型疑难样本. 关键词 ABO 血型 聚合酶链反应2序列特异性引物(PCR2SSP) 基因分型 Genotyping of ABO blood group and its application LAN Jiong2Cai ,MENG Qing2Bao , ZHANG Yin2Ze et al. Nanfang Hospital , First Military University , Guangzhou 510515 Abstract Objective :T o study on significance of ABO genotyping. Methods:T o use the methods of polymerase chain reaction 2sequence specific primers(PCR2SSP) for genotyping of ABO blood group and observation ABO gene polymorphism as well as identification of doubt sam 2 ple. Results:The reliability of the genotyping for ABO blood group was proved by testing DNA samples previously known genotypes. The results of genotyping for 104 healthy and unrelated HAN individuals were correspond with serological phenotypes. The method of ABO genotyping was applied for clinical pre2transfusion ABO typing ,pre2delivery fetal ABO typing ,parenting test and subgrouptyping. Conclusion : The method of ABO genotyping may correct typing for doubt sample of ABO serological typing. Key words ABO blood group Polymerase chain reaction2sequecific primer(PCR2SSP) Genotyping ABO 血型是目前最具临床意义的血型系统 ,常 规采用血清学技术定型 ,发现一些疑难标本不易准 确判定血型 ,产前胎儿血型检定因取血样困难或胎 儿红细胞抗原发育不成熟而受限制 ,亲权鉴定时因 只能确定表型而不能确定其基因型使一些表型相同 而基因型不合遗传规律的案例不能排除.为此 ,我 们采用了 ABO 血型基因分析技术并试用于临床 ,现 将结果报道如下. 1 材料与方法 111 标本 104 例随机非亲属汉族个体 ,其中男 55 人 ,女 49 人 ,年龄 18~48 岁,7 份已知 ABO 基因型 的DNA 由NIH 提供 ,基因型分别为 :A 1 Π A 1 2 份,A 1 Π O 1 1 份A1ΠA21份,A 1 B 1 份,BΠ O 1 1 份,A 1 Π O 2 1 份.疑 难血型鉴定例 ,其中 :3 例血清学技术正反定型不 符,1 例产前胎儿血型鉴定 ,2 例白血病化疗引起抗 作者简介 :兰炯采 ,男,56 岁 ,研究员 ,博士生导师 ,从事临床输血、 血 型研究 ; 孟庆宝 ,男,32 岁 ,临床输血硕士研究生. 原减弱 ,1 例法医亲子鉴定.从中国生物医学期刊 数据查得有关 ABO 亚型的个例报告 ,向作者函索标 本 ,血清学表型分别报道为 Bx、 AB2 、 A2B. 112 试剂与方法 11211 EDTA 抗凝的外周血 DNA 提取采用快速盐 析法 1 ,羊水 DNA 用经典的酚2氯仿法提取.DNA 终浓度调节至 100~300 ngΠ μ l . 11212 ABO 基因分型采用美国 G&T 公司的试剂 盒 ,内对照为扩增人类生长激素 (Human Growth Hor2 mone ,HGH) 基因的引物对 ,扩增产物为 429 bp .引 物设计及组成 (Mix) 参考 Akane 等报告并适当改 进2.引物混合物 (Mix) 的组成、 最佳反应浓度、 产 物片段和检测基因见表 1.PCR 产物以琼脂糖电 泳 ,紫外透射仪下判定结果. 2 结果 211 ABO 血型及亚型基因分型结果判断 :核酸标准 品Marker 为100 bp Landder ,每管含 429 bp 内对照. Mix21 至Mix27 用于检测 ABO 基因型 ,相应基因型样 · 0 3 4 · 中国免疫学杂志 2002 年第 18 卷表1引物混合物的组成、 最佳反应浓度及 PCR产物片段大小 Tab. 1 Primer mix composition ,optimum reaction concentration , PCR products( bp) and testing mutation gene Primer mixture Gene specificity Sense primer No. Concentration , μ molΠ L Anti2sense primer No. Concentration( μ molΠ L) Product (bp) Test mutation Mix21 O1 469 # 114 474 # 114 1 790 G261deletion(A262) Mix22 O2 470 # 114 474 # 114 253 G802A Mix23 B 484 # 114 474 # 114 252 G803C Mix24 O1 ,O2 ,A1 ,B 471 # 017 474 # 017 586 C467 Mix25 A1 ,A2 479 # 114 478 # 114 1 298 G261、 G526 Mix26 A2 ,A1 2) 472 # 017 474 # 017 587 G467T(A0102 and A0201) Mix27 A2 472 # 114 724 # 114 614 deletio (A0201) Mix28 Se 634 # 015 636 # 015 530 G447 Mix29 Se 635 # 015 636 # 015 532 G447A Mix210 Se 637 # 015 636 # 015 223 G757A 表2ABO 血型基因分布 Tab. 2 Distribution of ABO genotypes in H an population Genotyping Observation (Protortion) Expectation (Protortion) χ 2 O1 Π O1 33(01317 3) 26150(01254 8) 11594 3 A1 Π O1 11(01105 8) 16115(01155 3) 11642 3 A2 Π O1 7(01067 3) 10110(01097 1) 01951 5 A1 Π A2 3(01028 8) 3108(01029 6) A1 Π A1 4(01038 5) 2146(01023 7) A2 Π A2 3(01028 8) 0197(01009 3) 01582 9 A2 Π B 4(01038 5) 4191(01047 2) A1 Π B 10(01096 2) 7184(01075 4) 01595 1 BΠ B 8(01079 6) 6125(01060 1) 01490 0 BΠ O1 21(01201 9) 25175(01247 6) 01875 2 T otal 104(11000 0) 104101(11000 1) 61732 3 Note:χ2 = 6. 732 3 , P > 0125(when observation < 5 , χ 2 was calculated to2 gether v = 5) . Gene frequency ,A1 = 0. 015 38 ,A2 = 0. 962 ,B = 0. 245 2 ,O1 = 0. 504 8 ,O2 = nt. 本在该管 PCR 产物中出现相应 bp 的特异性片段. 212 用本文的方法对 7 份已知血型基因型的标本 定型获得准确结果 基因型分虽为 :A 1 Π A 1 2 份,A 1 Π O 1 1 份,A 1 Π A 2 1 份,A 1 Π B 1 份,BΠ O 1 1 份,A 1 Π O 2 1 份. 213 104 例非亲属个体的外周血标本进行 ABO 血 型及其亚型基因定型 ,同时用血清学卡式定型技术 (DiaMed Typing System) 鉴定表型.基因型与表型一 致率 100 %(血清学只鉴定 A、 B、 AB、 O 4 种表型) . 104 份血标本的 ABO 血型及其亚型定型结果见表 2. 214 ABO 基因定型的应用 21411 ABO 基因定型在疑难血型鉴定中的应用 例1:女,10 岁 ,因双侧臀肌挛缩入院手术.术前 ABO 血型血清学方法正、 反定型不符.正定型 :患 者红细胞加抗2A 不凝集 ,加抗2B 后镜下见数个红细 胞凝集 ;反定型 :患者血清与 B 型和 O 型试剂红细 胞不凝集.基因分型及家系调查 :患者及其母亲均 为BΠ O 1 型.术中给病人输 3 个单位配合的 B 型红 细胞 ,未见输血反应. 例2:男 ,62 岁 ,有 30 余年左肾结石史 ,就诊前 一日出现无诱因的头晕伴左侧肢体发抖和高血压 (180Π 100 mmHg) ,意识不清 ,呕吐 ,入南方医院治疗 , 门诊血压为 72Π 32 mmHg.入院后诊断为慢性肾功 能不全、 尿毒症、 代谢性酸中毒、 上消化道出血和肺 部感染 ,贫血(Hb 70 gΠ L) .临床血液透析并申请输 血.患者 ABO 血型正反定型结果不符.正定型 :患 者红细胞与抗 - A 反应呈 4 + ,与抗 - B 反应呈阴 性 ,定为 A 型.患者红细胞经 3 次洗涤后 ,结果同 前.反定型 :病人血清与 A1 试剂红细胞反应呈 1 + ~2 + ,与B试剂细胞反应呈 4 + .患者红细胞加抗 - A1 ,无反应性.抗体筛选阴性.RhD 阴性.表型 定为 A2 型.基因定型为 A 2 O 1 .选相合的血液输 注 ,无反应. 例3:女 ,47 岁 ,诊断为尿素症 ,欲施肾移植 ,术 前申请血型鉴定和配血.正定型 :患者红细胞与抗 血清反应为抗2A(4 + ) ,抗2A1 (4 + ) ,抗2B ( - ) ,抗2D (4 + ) ,定A1 型和 RhD ( + ) ,反定型 :患者血清与试 剂红细胞反应 ,Alc (3 + ) ,Bc (4 + ) ,Oc (2 + ) ,与自身 红细胞无反应性.血型不能确定.用抗体筛选细胞 检测 ,怀疑患者血清中存在不规则抗体 ,但用谱细胞 未能鉴定出抗体特异性.进行基因定型 ,基因型为 A 2 O 1 .进一步分析 ,患者正反定型不合系血浆蛋白 紊乱所致. 21412 ABO 基因定型在产前胎儿血型鉴定中的应 用 患者 ,女 ,湖北黄石人 ,妊2产1,第一胎 3 岁,AB 型 ,患地中海贫血.第2胎妊娠 8 个月 ,计划分 娩时采集脐带血对患儿作造血干细胞移植 ,申请产 前鉴定胎儿 ABO 血型、 HLA 及地中海贫血诊断. · 1 3 4 · 兰炯采等 ABO 血型基因分型及应用 第6期表3当事人 ABO、 MN、 Rh、 H LA 各系统鉴定结果 Tab. 3 The results of ABO、 MN、 Rha and H LA tested for involvement person ABO Serology typing Genotyping MN Rh HLA2A、 B、 DR、 DQ Father A A2 O1 MN CcDEe A2 ,24(9) ;B52(5) ,61(40) ;DR9 , —;DQ0303 ,05 Mother A A2 O1 MN CcDEe A24(9) ,33(19) ;B58(17) ,15 ;DR14(6) ,DR —;DQ06 , — Child A A1 O1 MN ccDEe A2 ,33(19) ;B52(5) ,58(17) ;DR14(6) , —,DQ05 ,06 常规消毒腹壁 ,B 超指导下用 9 号带针心的穿 刺针经腹壁进入羊膜腔抽取羊水.为防止穿刺过程 中母亲血混入羊水 ,前两次抽取的羊水弃去 (每次 1 ml ,每次换注射器) ,取第 3 次抽取的羊水 1 ml ,10 000 g 离心 10 min ,取沉淀物 ,生理盐水洗涤 3 次后 用经典的酚2氯仿法提取 DNA ,同时取 1 名幼儿外周 血 ,提取 DNA 备用.用本文的方法 ,羊水标本的基 因型定为 A 2 B. 21413 ABO 基因定型解决白血病化疗引起的血型 抗原减弱 例1:19 岁.头晕 ,乏力 ,胸闷 4 w 入院. 实验室检查 :WBC 916 *10 6 L - 1 , Hb 80 gΠ PLT 39 * 10 9 L - 1 .骨髓增生极度活跃 ,原幼单核细胞 58 % , 诊断为 AML2M5a ,给予对症及 "HA" 方案化疗.查血 型为 "B" 型 ,并先后输注同型血 1 200 ml .后因化 疗,PLT下降至 19 * 10 9 L - 1 ,再次申请输血 ,血型定 型时发现 "B" 型变为 "O" 型.因与以前血型不一致 , 考虑为化疗引起的血型抗原减弱.随之进行基因定 型 ,为 BO 1 型.输注同型血小板 ,密切观察输注过 程 ,无任何不良反应. 例2:男 ,36 岁,1988 年5月确诊为慢性粒细胞 性白血病(慢性期) .经羟基脲、 别嘌呤醇治疗 ,病情 部分缓解 ,继续羟基脲维持治疗.2001 年3月又因 头昏、 紫癜入院 ,诊断为 "慢性粒细胞性白血病急变、 急性淋巴细胞白血病变态转变" 入院.入院时常规 血型鉴定为 "AB" 型,RhD ( + ) 阳性.予VP 化疗 ,化 疗过程中申请输血 ,但再次定型时为 "A" 型.分析 病人可能为化疗引起的 B 抗原减弱 ,随之进行基因 定型 ,为A1B,输注 AB 型血无不良反应. 21414 ABO 血型基因定型在亲子鉴定中的应用 某男 ,与妻子有一子 ,对其进行亲子鉴定 ,ABO、 MN、 Rh、 HLA 各系统鉴定结果见表 3.从表 3 中ABO 基 因分型结果看出可以排除亲子关系.委托中国政法 大学司法鉴定中心进一步鉴定 ,报道如下 : "从3人样本(抗凝血各 6 ml) ,分别提取各被鉴 定的 DNA 检材 ,经Hinf I 酶解 ,琼脂糖凝胶电泳 ,真 空转移到尼龙膜上 ,用辣根过氧化酶标记 JL202 探 针杂交后自显影得到指纹图.在414 kb 以上的谱 带中 ,母亲有 25 条 ,父亲有 23 条 ,儿子有 19 条.在 儿子的 19 条带中 10 条在母亲谱带中找到位置相同 的带 ,2 条在父亲的谱带中找到位置相同的带 ,3 人 共有带 2 条 ,另外 5 条带来路不明.经鉴定 ,可以排 除子与父的亲子关系. " 21415 已报道的血清学 ABO 亚型与基因型的一致 性初探 3 份已在国内报道的表型为 Bx、 AB2、 A2B 的血标本 ,用本文的 7 对引物方法进行基因定型 ,基 因型分别为 O 1 Π O 1 、 A 2 Π O 1 、 BΠ O 1 . 3 讨论 1900 年Yamamoto Y 等成功地克隆了编码糖基 转移酶的 cDNA 并测序 ,使得从基因水平鉴定 ABO 血型成为可能 3 .对编码 ABO 血型 A1 抗原的糖基 转移酶基因的序列分析 ,提示其 cDNA 长度为 1 062 bp ,有7个外显子 ,编码蛋白质的分子量为 41 kD. 编码 ABO 血型物质的其它基因的 DNA 序列相继研 究清楚 ,发现它们与 A 1 (A0101 ) 的DNA 序列紧密相 关 ,仅有几个碱基的替换或单个碱基的缺失.B 转 移酶基因仅在于 97、 526、 657、 703、 796、 803 和930 位 置与 A1 转移酶基因有差异 ,导致在以下位置的 4 个 氨基 酸替代:C526G ( Arg2Gly) , G703A ( Gly2Ser ) , C796A(Leu2Met) , G803C ( Gly2Ala) 4 .A 1(2) (A0102 ) 与A1的差异只是位单碱基的替换 ( G467T ,Pro2Leu) 和1059位的 C 缺失 ,导致成熟蛋白质 C 端功能区的变 化5.O 1 基因与 A 1 的区别是编码区的第 261 位核 苷酸缺失 ( G 缺失) ,引起阅读框移动 ,在351~354 位置产生终止密码子 6 .O 2 基因与 A 1 的区别在于 97 位、 526 位、 802 位置的核苷酸不同 ,而只有 C526G (Arg2Gly) 、 G802A ( Gly2Arg) 替换引起氨基酸的变 化7.根据 ABO 及其亚型的突变位点设计出 PCR2 SSP 检测技术 ,成功地检定 ABO 基因型并用于血清 学疑难样本分析.本文检测 104 例汉族人群的 ABO 基因频率 ,分别为 :A 1 :01153 8、 A 2 :01096 2、 B :01245 2、 O 1 :01504 8、 O 2 未检到.目前已知 O 基因有 O 1 、 O 2 和OⅣ等,香港 O 2 基因频率高达 01250 8 ,A 2 仅为 01015 9 ;欧洲 O 2 属罕见基因 ,但A2则约占 A 表型 · 2 3 4 · 中国免疫学杂志 2002 年第 18 卷的20 %.Iwaski 等对我国汉族人群的调查也没检出 O 2 基因.这种分布的特点待检测大量的标本进行 证实.本组样本的血清学结果与 DNA 分型结果一 致 ,说明 ABO 血清学分型方法用于常规基本可靠 , ABO DNA 分型技术不是要取代血清学分型技术 ,而 是用于弥补血清学技术的不足之种 ,特别是疑难样 本的分析.本文报告的 ABO 血型 PCR2SSP 基因定 型技术因其分型准确、 快速、 需要检材少等优点 ,成 功地用于产前胎儿血型诊断、 白血病引起的抗原异 常和其它疑难血型鉴定.本文所述的亲子鉴定案 例 ,在应用常规方法分析 ABO、 MN、 Rh 及HLA2A、 B、 DR、 DQ 系统不排除亲子关系的情况下 ,通过 ABO 亚型基因否定了亲子关系 ,并得到了指纹图谱结果 的证实.在临床输血、 法医学和遗传学等领域将具 有广泛的应用前景. 笔者通过对已报道的血清学 ABO 亚型的基因 型鉴定 ,提示血清学亚型的报道的不可靠性 ,鉴于目 前我国对血清学亚型报告较多 ,且均缺乏核苷酸突 变的实验数据 ,建议对血清学反应特殊标本 ,不要轻 易报告为 ABO 亚型 ,最好用基因定型方法确认 ,必 要时可进行核苷酸测序.另外对血清学反应格局特 殊的标本建议送国家或区域性参比实验室确认 ,避 免误报. 人类红细胞血型血清学技术虽然相对较完善和 标准化 ,但其只能鉴定表型 ,在鉴定某些异常表达的 个体和作遗传学分析时受到局限.基因分型技术克 服了血型血清学方法不可逾越的种种限制 ,本组样 本表明其优点是(1) 不受检材限制 ,各种有核细胞如 毛囊、 组织块、 血痕、 羊水、 精斑等都可作为检材而不 必考虑表达问题.本文报告产前胎儿 ABO 血型鉴 定1例,如用血清学方法便难以取得满意结果 ; (2) 不受血清中自身抗体、 不规则抗体的影响 ; (3) 不受 疾病的影响 ,某些疾病如肿瘤、 白血病等引起的血型 抗原表达异常所致的血型 "转变" 可直接定基因型 ; (4) 可快速解决血型鉴定中的假凝集弱凝集(如细菌 污染、 血浆蛋白紊乱等所致) 现象 ; (5) 由于可鉴定亚 型、 纯合子、 杂合子 ,在法医个体识别中具有更高的 分辨力 ; (6) 标本的运输、 传递不受时空限制 ,不同实 验室之间的结果更具可比性 ; (7) 基因分型可直接检 测血型基因型 ,基因多态性分布可用基因直接计数 法统计计算 ,而血清学基因型推断需用家系调查 ,基 因多态性分布需根据 Wiener、 Bernstein 或最大似然 法统计推断计算. 致谢 :感谢美国 NIH 赵桐茂教授及 G&T 公司指导. 4 参考文献 1 Miller S A ,Dykes M A ,Leelayumat C et al. A simple salting out proce2 dure for extracting DNA from human nucleated cells J . Nucleic Acids Res ,1998 ;16 :1215 2 Y oshimuras A A ,Y oshida M. ABO genetyping following a single PCR am2 plificationJ . Forensic Sci ,1996 ;42 (2) :272 3 Yamamoto F ,Marken J , Tsuji T et al. Cloning and characterization of DNA complementary to human UDP2GalNAc : Fucal2Gal2Nac transferase (Histo2blood group A transferse) mRNA J . J Bio Chem ,1996 ;42 (2) : 272 4 Yamamoto F ,Clausen H ,White T et al. Molecular genetic basis of histo2 blood group ABO systemJ . Nature ,1990 ;354 :229 5 Yamamoto F ,McNeill P D ,Hakamori S et al. Human histo2blood group A2 transferase coded by A2 allele ,one of the a subtypes ,is characterized by a single base deletion in sequence ,which results in an additional doma2 in at carboxyl terminalJ . Biochem Biophys Res Commun ,1992 ;187 :366 6 Yamamoto F ,Mcneill P D ,Yamamoto M et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system:4 another type of O alleleJ . VoX Sang , 1993 ;64 ;175 7 Yamamoto F. Molecular genetics of the ABO histo2blood group systemJ . Vox Sang ,1995 ;69 :1 [收稿 2001207229 修回 2001210226 (编辑 许四平) · 征订启事· 欢迎订阅 2002 年 《中国免疫学杂志》 《中国免疫学杂志》 是中国免疫学会会刊 ,是国内外公开发行的中央级学术期刊 ,为基础医学、 生物学的核心期刊 ,是美国 化学文摘(CA) 及科学引文索引(SCI) 的源期刊 ,中国首批期刊方阵双效期刊 ,中国科学引文数据库、 中国学术期刊文摘、 中国 生物医学文摘的来源期刊.本刊主要栏目有分子与细胞免疫学、 遗传免疫学、 免疫药理学、 神经内分泌与免疫、 肿瘤免疫学、 临床免疫学、 生殖免疫学、 免疫学技术与方法、 中医中药与免疫、 兽医免疫学、 教学园地、 述评、 专题综述等 ,并开设了国内外免 疫学研究的重点、 热点、 前沿课题等专题讲座专栏 ,不仅内容更新更快 ,而且信息更大. 本刊为月刊、 国际大 16 开,2002 年起改为 72 页 ,增加临床免疫的内容 ,开设了实用临床免疫学栏目.定价 7100 元 ,全年 84100 元 ,邮发代号 12289 ,全国邮局均可订阅.为减轻自费读者负担 ,对自费个人订户实行八折优惠 ,每本 6100 元 (含邮费) , 如错过订阅时间可直接汇款到 《中国免疫学杂志》 编辑部 ,请注明所购卷期、 册数及 "自费" 字样时.同样欢迎医药、 生物制剂、 医疗器械厂家刊登广告及作者网上投稿. 地址 :长春市建政路 15 号 《中国免疫学杂志》 编辑部 邮编 :130061 电话 :0431 — 8925027 传真 :0431 — 8925027 E2mail :zhongmz @ mail. jl. cn zhmizaz cn @ sina. com 《中国免疫学杂志》 编辑部 · 3 3 4 · 兰炯采等 ABO 血型基因分型及应用 第6期
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· 实用临床免疫学· ABO 血型基因分型及应用 兰炯采 孟庆宝 张印则 周华发 王从容 曹琼(第一军医大学南方医院输血科 ,广州 510515) 刘忠(合肥血液中心 ,合肥 230022) 中国图书分类号 R45711 + 文献标识码 A 文章编号 10002484X( 2002) 0620430204 摘要目的 :研究 ABO 血型基因分型的意义.方法 :采用聚合酶链反应2序列特异性引物 (PCR2SSP) 基因定型方法对 ABO 血型基因定型并观察其基因多态性分布特征和疑难血型检定.结果 :对已知 ABO 基因的 DNA 标本进行基因定型 ,证实 文中的 ABO 基因定型方法可靠 ;对104 例健康、 无血源关系的汉族个体 ABO 血型基因定型 ,结果与血清学所定表型完全符合 ; 并用 ABO 基因分型技术解决临床输血前血型鉴定、 产前胎儿血型鉴定、 亲权试验及血清学亚型的正确性验证.结论 :ABO 血 型基因分型技术可以正确判定 ABO 血型疑难样本. 关键词 ABO 血型 聚合酶链反应2序列特异性引物(PCR2SSP) 基因分型 Genotyping of ABO blood group and its application LAN Jiong2Cai ,MENG Qing2Bao , ZHANG Yin2Ze et al. Nanfang Hospital , First Military University , Guangzhou 510515 Abstract Objective :T o study on significance of ABO genotyping. Methods:T o use the methods of polymerase chain reaction 2sequence specific primers(PCR2SSP) for genotyping of ABO blood group and observation ABO gene polymorphism as well as identification of doubt sam 2 ple. Results:The reliability of the genotyping for ABO blood group was proved by testing DNA samples previously known genotypes. The results of genotyping for 104 healthy and unrelated HAN individuals were correspond with serological phenotypes. The method of ABO genotyping was applied for clinical pre2transfusion ABO typing ,pre2delivery fetal ABO typing ,parenting test and subgrouptyping. Conclusion : The method of ABO genotyping may correct typing for doubt sample of ABO serological typing. Key words ABO blood group Polymerase chain reaction2sequecific primer(PCR2SSP) Genotyping ABO 血型是目前最具临床意义的血型系统 ,常 规采用血清学技术定型 ,发现一些疑难标本不易准 确判定血型 ,产前胎儿血型检定因取血样困难或胎 儿红细胞抗原发育不成熟而受限制 ,亲权鉴定时因 只能确定表型而不能确定其基因型使一些表型相同 而基因型不合遗传规律的案例不能排除.为此 ,我 们采用了 ABO 血型基因分析技术并试用于临床 ,现 将结果报道如下. 1 材料与方法 111 标本 104 例随机非亲属汉族个体 ,其中男 55 人 ,女 49 人 ,年龄 18~48 岁,7 份已知 ABO 基因型 的DNA 由NIH 提供 ,基因型分别为 :A 1 Π A 1 2 份,A 1 Π O 1 1 份A1ΠA21份,A 1 B 1 份,BΠ O 1 1 份,A 1 Π O 2 1 份.疑 难血型鉴定例 ,其中 :3 例血清学技术正反定型不 符,1 例产前胎儿血型鉴定 ,2 例白血病化疗引起抗 作者简介 :兰炯采 ,男,56 岁 ,研究员 ,博士生导师 ,从事临床输血、 血 型研究 ; 孟庆宝 ,男,32 岁 ,临床输血硕士研究生. 原减弱 ,1 例法医亲子鉴定.从中国生物医学期刊 数据查得有关 ABO 亚型的个例报告 ,向作者函索标 本 ,血清学表型分别报道为 Bx、 AB2 、 A2B. 112 试剂与方法 11211 EDTA 抗凝的外周血 DNA 提取采用快速盐 析法 1 ,羊水 DNA 用经典的酚2氯仿法提取.DNA 终浓度调节至 100~300 ngΠ μ l . 11212 ABO 基因分型采用美国 G&T 公司的试剂 盒 ,内对照为扩增人类生长激素 (Human Growth Hor2 mone ,HGH) 基因的引物对 ,扩增产物为 429 bp .引 物设计及组成 (Mix) 参考 Akane 等报告并适当改 进2.引物混合物 (Mix) 的组成、 最佳反应浓度、 产 物片段和检测基因见表 1.PCR 产物以琼脂糖电 泳 ,紫外透射仪下判定结果. 2 结果 211 ABO 血型及亚型基因分型结果判断 :核酸标准 品Marker 为100 bp Landder ,每管含 429 bp 内对照. Mix21 至Mix27 用于检测 ABO 基因型 ,相应基因型样 · 0 3 4 · 中国免疫学杂志 2002 年第 18 卷表1引物混合物的组成、 最佳反应浓度及 PCR产物片段大小 Tab. 1 Primer mix composition ,optimum reaction concentration , PCR products( bp) and testing mutation gene Primer mixture Gene specificity Sense primer No. Concentration , μ molΠ L Anti2sense primer No. Concentration( μ molΠ L) Product (bp) Test mutation Mix21 O1 469 # 114 474 # 114 1 790 G261deletion(A262) Mix22 O2 470 # 114 474 # 114 253 G802A Mix23 B 484 # 114 474 # 114 252 G803C Mix24 O1 ,O2 ,A1 ,B 471 # 017 474 # 017 586 C467 Mix25 A1 ,A2 479 # 114 478 # 114 1 298 G261、 G526 Mix26 A2 ,A1 2) 472 # 017 474 # 017 587 G467T(A0102 and A0201) Mix27 A2 472 # 114 724 # 114 614 deletio (A0201) Mix28 Se 634 # 015 636 # 015 530 G447 Mix29 Se 635 # 015 636 # 015 532 G447A Mix210 Se 637 # 015 636 # 015 223 G757A 表2ABO 血型基因分布 Tab. 2 Distribution of ABO genotypes in H an population Genotyping Observation (Protortion) Expectation (Protortion) χ 2 O1 Π O1 33(01317 3) 26150(01254 8) 11594 3 A1 Π O1 11(01105 8) 16115(01155 3) 11642 3 A2 Π O1 7(01067 3) 10110(01097 1) 01951 5 A1 Π A2 3(01028 8) 3108(01029 6) A1 Π A1 4(01038 5) 2146(01023 7) A2 Π A2 3(01028 8) 0197(01009 3) 01582 9 A2 Π B 4(01038 5) 4191(01047 2) A1 Π B 10(01096 2) 7184(01075 4) 01595 1 BΠ B 8(01079 6) 6125(01060 1) 01490 0 BΠ O1 21(01201 9) 25175(01247 6) 01875 2 T otal 104(11000 0) 104101(11000 1) 61732 3 Note:χ2 = 6. 732 3 , P > 0125(when observation < 5 , χ 2 was calculated to2 gether v = 5) . Gene frequency ,A1 = 0. 015 38 ,A2 = 0. 962 ,B = 0. 245 2 ,O1 = 0. 504 8 ,O2 = nt. 本在该管 PCR 产物中出现相应 bp 的特异性片段. 212 用本文的方法对 7 份已知血型基因型的标本 定型获得准确结果 基因型分虽为 :A 1 Π A 1 2 份,A 1 Π O 1 1 份,A 1 Π A 2 1 份,A 1 Π B 1 份,BΠ O 1 1 份,A 1 Π O 2 1 份. 213 104 例非亲属个体的外周血标本进行 ABO 血 型及其亚型基因定型 ,同时用血清学卡式定型技术 (DiaMed Typing System) 鉴定表型.基因型与表型一 致率 100 %(血清学只鉴定 A、 B、 AB、 O 4 种表型) . 104 份血标本的 ABO 血型及其亚型定型结果见表 2. 214 ABO 基因定型的应用 21411 ABO 基因定型在疑难血型鉴定中的应用 例1:女,10 岁 ,因双侧臀肌挛缩入院手术.术前 ABO 血型血清学方法正、 反定型不符.正定型 :患 者红细胞加抗2A 不凝集 ,加抗2B 后镜下见数个红细 胞凝集 ;反定型 :患者血清与 B 型和 O 型试剂红细 胞不凝集.基因分型及家系调查 :患者及其母亲均 为BΠ O 1 型.术中给病人输 3 个单位配合的 B 型红 细胞 ,未见输血反应. 例2:男 ,62 岁 ,有 30 余年左肾结石史 ,就诊前 一日出现无诱因的头晕伴左侧肢体发抖和高血压 (180Π 100 mmHg) ,意识不清 ,呕吐 ,入南方医院治疗 , 门诊血压为 72Π 32 mmHg.入院后诊断为慢性肾功 能不全、 尿毒症、 代谢性酸中毒、 上消化道出血和肺 部感染 ,贫血(Hb 70 gΠ L) .临床血液透析并申请输 血.患者 ABO 血型正反定型结果不符.正定型 :患 者红细胞与抗 - A 反应呈 4 + ,与抗 - B 反应呈阴 性 ,定为 A 型.患者红细胞经 3 次洗涤后 ,结果同 前.反定型 :病人血清与 A1 试剂红细胞反应呈 1 + ~2 + ,与B试剂细胞反应呈 4 + .患者红细胞加抗 - A1 ,无反应性.抗体筛选阴性.RhD 阴性.表型 定为 A2 型.基因定型为 A 2 O 1 .选相合的血液输 注 ,无反应. 例3:女 ,47 岁 ,诊断为尿素症 ,欲施肾移植 ,术 前申请血型鉴定和配血.正定型 :患者红细胞与抗 血清反应为抗2A(4 + ) ,抗2A1 (4 + ) ,抗2B ( - ) ,抗2D (4 + ) ,定A1 型和 RhD ( + ) ,反定型 :患者血清与试 剂红细胞反应 ,Alc (3 + ) ,Bc (4 + ) ,Oc (2 + ) ,与自身 红细胞无反应性.血型不能确定.用抗体筛选细胞 检测 ,怀疑患者血清中存在不规则抗体 ,但用谱细胞 未能鉴定出抗体特异性.进行基因定型 ,基因型为 A 2 O 1 .进一步分析 ,患者正反定型不合系血浆蛋白 紊乱所致. 21412 ABO 基因定型在产前胎儿血型鉴定中的应 用 患者 ,女 ,湖北黄石人 ,妊2产1,第一胎 3 岁,AB 型 ,患地中海贫血.第2胎妊娠 8 个月 ,计划分 娩时采集脐带血对患儿作造血干细胞移植 ,申请产 前鉴定胎儿 ABO 血型、 HLA 及地中海贫血诊断. · 1 3 4 · 兰炯采等 ABO 血型基因分型及应用 第6期表3当事人 ABO、 MN、 Rh、 H LA 各系统鉴定结果 Tab. 3 The results of ABO、 MN、 Rha and H LA tested for involvement person ABO Serology typing Genotyping MN Rh HLA2A、 B、 DR、 DQ Father A A2 O1 MN CcDEe A2 ,24(9) ;B52(5) ,61(40) ;DR9 , —;DQ0303 ,05 Mother A A2 O1 MN CcDEe A24(9) ,33(19) ;B58(17) ,15 ;DR14(6) ,DR —;DQ06 , — Child A A1 O1 MN ccDEe A2 ,33(19) ;B52(5) ,58(17) ;DR14(6) , —,DQ05 ,06 常规消毒腹壁 ,B 超指导下用 9 号带针心的穿 刺针经腹壁进入羊膜腔抽取羊水.为防止穿刺过程 中母亲血混入羊水 ,前两次抽取的羊水弃去 (每次 1 ml ,每次换注射器) ,取第 3 次抽取的羊水 1 ml ,10 000 g 离心 10 min ,取沉淀物 ,生理盐水洗涤 3 次后 用经典的酚2氯仿法提取 DNA ,同时取 1 名幼儿外周 血 ,提取 DNA 备用.用本文的方法 ,羊水标本的基 因型定为 A 2 B. 21413 ABO 基因定型解决白血病化疗引起的血型 抗原减弱 例1:19 岁.头晕 ,乏力 ,胸闷 4 w 入院. 实验室检查 :WBC 916 *10 6 L - 1 , Hb 80 gΠ PLT 39 * 10 9 L - 1 .骨髓增生极度活跃 ,原幼单核细胞 58 % , 诊断为 AML2M5a ,给予对症及 "HA" 方案化疗.查血 型为 "B" 型 ,并先后输注同型血 1 200 ml .后因化 疗,PLT下降至 19 * 10 9 L - 1 ,再次申请输血 ,血型定 型时发现 "B" 型变为 "O" 型.因与以前血型不一致 , 考虑为化疗引起的血型抗原减弱.随之进行基因定 型 ,为 BO 1 型.输注同型血小板 ,密切观察输注过 程 ,无任何不良反应. 例2:男 ,36 岁,1988 年5月确诊为慢性粒细胞 性白血病(慢性期) .经羟基脲、 别嘌呤醇治疗 ,病情 部分缓解 ,继续羟基脲维持治疗.2001 年3月又因 头昏、 紫癜入院 ,诊断为 "慢性粒细胞性白血病急变、 急性淋巴细胞白血病变态转变" 入院.入院时常规 血型鉴定为 "AB" 型,RhD ( + ) 阳性.予VP 化疗 ,化 疗过程中申请输血 ,但再次定型时为 "A" 型.分析 病人可能为化疗引起的 B 抗原减弱 ,随之进行基因 定型 ,为A1B,输注 AB 型血无不良反应. 21414 ABO 血型基因定型在亲子鉴定中的应用 某男 ,与妻子有一子 ,对其进行亲子鉴定 ,ABO、 MN、 Rh、 HLA 各系统鉴定结果见表 3.从表 3 中ABO 基 因分型结果看出可以排除亲子关系.委托中国政法 大学司法鉴定中心进一步鉴定 ,报道如下 : "从3人样本(抗凝血各 6 ml) ,分别提取各被鉴 定的 DNA 检材 ,经Hinf I 酶解 ,琼脂糖凝胶电泳 ,真 空转移到尼龙膜上 ,用辣根过氧化酶标记 JL202 探 针杂交后自显影得到指纹图.在414 kb 以上的谱 带中 ,母亲有 25 条 ,父亲有 23 条 ,儿子有 19 条.在 儿子的 19 条带中 10 条在母亲谱带中找到位置相同 的带 ,2 条在父亲的谱带中找到位置相同的带 ,3 人 共有带 2 条 ,另外 5 条带来路不明.经鉴定 ,可以排 除子与父的亲子关系. " 21415 已报道的血清学 ABO 亚型与基因型的一致 性初探 3 份已在国内报道的表型为 Bx、 AB2、 A2B 的血标本 ,用本文的 7 对引物方法进行基因定型 ,基 因型分别为 O 1 Π O 1 、 A 2 Π O 1 、 BΠ O 1 . 3 讨论 1900 年Yamamoto Y 等成功地克隆了编码糖基 转移酶的 cDNA 并测序 ,使得从基因水平鉴定 ABO 血型成为可能 3 .对编码 ABO 血型 A1 抗原的糖基 转移酶基因的序列分析 ,提示其 cDNA 长度为 1 062 bp ,有7个外显子 ,编码蛋白质的分子量为 41 kD. 编码 ABO 血型物质的其它基因的 DNA 序列相继研 究清楚 ,发现它们与 A 1 (A0101 ) 的DNA 序列紧密相 关 ,仅有几个碱基的替换或单个碱基的缺失.B 转 移酶基因仅在于 97、 526、 657、 703、 796、 803 和930 位 置与 A1 转移酶基因有差异 ,导致在以下位置的 4 个 氨基 酸替代:C526G ( Arg2Gly) , G703A ( Gly2Ser ) , C796A(Leu2Met) , G803C ( Gly2Ala) 4 .A 1(2) (A0102 ) 与A1的差异只是位单碱基的替换 ( G467T ,Pro2Leu) 和1059位的 C 缺失 ,导致成熟蛋白质 C 端功能区的变 化5.O 1 基因与 A 1 的区别是编码区的第 261 位核 苷酸缺失 ( G 缺失) ,引起阅读框移动 ,在351~354 位置产生终止密码子 6 .O 2 基因与 A 1 的区别在于 97 位、 526 位、 802 位置的核苷酸不同 ,而只有 C526G (Arg2Gly) 、 G802A ( Gly2Arg) 替换引起氨基酸的变 化7.根据 ABO 及其亚型的突变位点设计出 PCR2 SSP 检测技术 ,成功地检定 ABO 基因型并用于血清 学疑难样本分析.本文检测 104 例汉族人群的 ABO 基因频率 ,分别为 :A 1 :01153 8、 A 2 :01096 2、 B :01245 2、 O 1 :01504 8、 O 2 未检到.目前已知 O 基因有 O 1 、 O 2 和OⅣ等,香港 O 2 基因频率高达 01250 8 ,A 2 仅为 01015 9 ;欧洲 O 2 属罕见基因 ,但A2则约占 A 表型 · 2 3 4 · 中国免疫学杂志 2002 年第 18 卷的20 %.Iwaski 等对我国汉族人群的调查也没检出 O 2 基因.这种分布的特点待检测大量的标本进行 证实.本组样本的血清学结果与 DNA 分型结果一 致 ,说明 ABO 血清学分型方法用于常规基本可靠 , ABO DNA 分型技术不是要取代血清学分型技术 ,而 是用于弥补血清学技术的不足之种 ,特别是疑难样 本的分析.本文报告的 ABO 血型 PCR2SSP 基因定 型技术因其分型准确、 快速、 需要检材少等优点 ,成 功地用于产前胎儿血型诊断、 白血病引起的抗原异 常和其它疑难血型鉴定.本文所述的亲子鉴定案 例 ,在应用常规方法分析 ABO、 MN、 Rh 及HLA2A、 B、 DR、 DQ 系统不排除亲子关系的情况下 ,通过 ABO 亚型基因否定了亲子关系 ,并得到了指纹图谱结果 的证实.在临床输血、 法医学和遗传学等领域将具 有广泛的应用前景. 笔者通过对已报道的血清学 ABO 亚型的基因 型鉴定 ,提示血清学亚型的报道的不可靠性 ,鉴于目 前我国对血清学亚型报告较多 ,且均缺乏核苷酸突 变的实验数据 ,建议对血清学反应特殊标本 ,不要轻 易报告为 ABO 亚型 ,最好用基因定型方法确认 ,必 要时可进行核苷酸测序.另外对血清学反应格局特 殊的标本建议送国家或区域性参比实验室确认 ,避 免误报. 人类红细胞血型血清学技术虽然相对较完善和 标准化 ,但其只能鉴定表型 ,在鉴定某些异常表达的 个体和作遗传学分析时受到局限.基因分型技术克 服了血型血清学方法不可逾越的种种限制 ,本组样 本表明其优点是(1) 不受检材限制 ,各种有核细胞如 毛囊、 组织块、 血痕、 羊水、 精斑等都可作为检材而不 必考虑表达问题.本文报告产前胎儿 ABO 血型鉴 定1例,如用血清学方法便难以取得满意结果 ; (2) 不受血清中自身抗体、 不规则抗体的影响 ; (3) 不受 疾病的影响 ,某些疾病如肿瘤、 白血病等引起的血型 抗原表达异常所致的血型 "转变" 可直接定基因型 ; (4) 可快速解决血型鉴定中的假凝集弱凝集(如细菌 污染、 血浆蛋白紊乱等所致) 现象 ; (5) 由于可鉴定亚 型、 纯合子、 杂合子 ,在法医个体识别中具有更高的 分辨力 ; (6) 标本的运输、 传递不受时空限制 ,不同实 验室之间的结果更具可比性 ; (7) 基因分型可直接检 测血型基因型 ,基因多态性分布可用基因直接计数 法统计计算 ,而血清学基因型推断需用家系调查 ,基 因多态性分布需根据 Wiener、 Bernstein 或最大似然 法统计推断计算. 致谢 :感谢美国 NIH 赵桐茂教授及 G&T 公司指导. 4 参考文献 1 Miller S A ,Dykes M A ,Leelayumat C et al. A simple salting out proce2 dure for extracting DNA from human nucleated cells J . Nucleic Acids Res ,1998 ;16 :1215 2 Y oshimuras A A ,Y oshida M. ABO genetyping following a single PCR am2 plificationJ . Forensic Sci ,1996 ;42 (2) :272 3 Yamamoto F ,Marken J , Tsuji T et al. Cloning and characterization of DNA complementary to human UDP2GalNAc : Fucal2Gal2Nac transferase (Histo2blood group A transferse) mRNA J . J Bio Chem ,1996 ;42 (2) : 272 4 Yamamoto F ,Clausen H ,White T et al. Molecular genetic basis of histo2 blood group ABO systemJ . Nature ,1990 ;354 :229 5 Yamamoto F ,McNeill P D ,Hakamori S et al. Human histo2blood group A2 transferase coded by A2 allele ,one of the a subtypes ,is characterized by a single base deletion in sequence ,which results in an additional doma2 in at carboxyl terminalJ . Biochem Biophys Res Commun ,1992 ;187 :366 6 Yamamoto F ,Mcneill P D ,Yamamoto M et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system:4 another type of O alleleJ . VoX Sang , 1993 ;64 ;175 7 Yamamoto F. Molecular genetics of the ABO histo2blood group systemJ . Vox Sang ,1995 ;69 :1 [收稿 2001207229 修回 2001210226 (编辑 许四平) · 征订启事· 欢迎订阅 2002 年 《中国免疫学杂志》 《中国免疫学杂志》 是中国免疫学会会刊 ,是国内外公开发行的中央级学术期刊 ,为基础医学、 生物学的核心期刊 ,是美国 化学文摘(CA) 及科学引文索引(SCI) 的源期刊 ,中国首批期刊方阵双效期刊 ,中国科学引文数据库、 中国学术期刊文摘、 中国 生物医学文摘的来源期刊.本刊主要栏目有分子与细胞免疫学、 遗传免疫学、 免疫药理学、 神经内分泌与免疫、 肿瘤免疫学、 临床免疫学、 生殖免疫学、 免疫学技术与方法、 中医中药与免疫、 兽医免疫学、 教学园地、 述评、 专题综述等 ,并开设了国内外免 疫学研究的重点、 热点、 前沿课题等专题讲座专栏 ,不仅内容更新更快 ,而且信息更大. 本刊为月刊、 国际大 16 开,2002 年起改为 72 页 ,增加临床免疫的内容 ,开设了实用临床免疫学栏目.定价 7100 元 ,全年 84100 元 ,邮发代号 12289 ,全国邮局均可订阅.为减轻自费读者负担 ,对自费个人订户实行八折优惠 ,每本 6100 元 (含邮费) , 如错过订阅时间可直接汇款到 《中国免疫学杂志》 编辑部 ,请注明所购卷期、 册数及 "自费" 字样时.同样欢迎医药、 生物制剂、 医疗器械厂家刊登广告及作者网上投稿. 地址 :长春市建政路 15 号 《中国免疫学杂志》 编辑部 邮编 :130061 电话 :0431 — 8925027 传真 :0431 — 8925027 E2mail :zhongmz @ mail. jl. cn zhmizaz cn @ sina. com 《中国免疫学杂志》 编辑部 · 3 3 4 · 兰炯采等 ABO 血型基因分型及应用 第6期