大鼠尿微量白蛋白(ALB)酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书
本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA 法定量测定大鼠尿液或其它相关生物液体中 ALB 含量.
实验原理 用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗 ALB 抗体的微孔中依次加入标本或标 准品,生物素化的抗 ALB 抗体,HRP 标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色. TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅 和样品中的 ALB 呈正相关.用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度( OD 值),计算样品 浓度.
试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板:一块(96 孔) 2. 标准品(冻干品): 2 瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml,盖好后静置 10 分钟以 上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为 200 ug/ml,做系列倍比稀释(注:不要直接在 板中进行倍比稀释) 分别稀释成 200 ug/ml,100 ug/ml,50 ug/ml,25 ug/ml,12.5 ug/ml,6.25 后, ug/ml,3.12 ug/ml, 样品稀释液直接作为标准浓度 0 ug/ml, 临用前 15 分钟内配制. 如配制 100 ug/ml 标准品:取 0.5ml (不要少于 0.5ml ) 200 ug/ml 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品 稀释液的 Eppendorf 管中,混匀即可,其余浓度以此类推. 3. 样品稀释液:1×20ml. 4. 检测稀释液 A:1×10ml. 5. 检测稀释液 B:1×10ml. 6. 检测溶液 A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液 A 1:100 稀释,稀释前根据预先计算
好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml.如 10μl 检测 溶液 A 加 990μl 检测稀释液 A 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制. 7. 检测溶液 B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液 B 1:100 稀释.稀释方法同检测溶 液 A. 8. 底物溶液:1×10ml/瓶. 9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍. 10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4). 11. 覆膜:5 张 12. 使用说明书:1 份
自备物品 1. 2. 3. 酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热) 微量加液器及吸头,EP 管 蒸馏水或去离子水,全新滤纸
标本的采集及保存 1. 尿液:请收集清晨第一次尿液(中段尿),或 24 小时尿液,2000 x g 离心 15 分钟后收集 上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融. 2. 其它生物标本:请 1000 x g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本放于 -20℃或-80℃ 保存,但应避免反复冻融. 注: 以上标本置 4℃保存应小于 1 周 ,-20℃或-80℃均应密封保存, -20℃不应超过 1 个 月 , -80 ℃不应超过 2 个月;
操作步骤 实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在 37℃溶解);试 剂或样品稀释时, 均需混匀,混匀时尽量避免起泡.实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进
行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数. 1. 加样:分别设空白孔,标准孔,待测样品孔.空白孔加样品稀释液 100μl,余孔分别加标 准品或待测样品 100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁 , 轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应 120 分钟.为保证实验结果有效性,每次实 验请使用新的标准品溶液. 2. 弃去液体,甩干, 不用洗涤.每孔加 检测溶液 A 工作液 100μl(在使用前一小时内配制 ) , 酶标板加上覆膜,37℃反应 60 分钟. 3. 温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分钟,大约 400μl/每孔, 甩干(也可轻拍将孔内液体拍干). 4. 每孔加检测溶液 B 工作液 (同检测 A 工作液) 100μl, 酶标板加上覆膜 37℃反应 60 分钟 . 5. 温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 5 次,每次浸泡 1-2 分钟,350μl/每孔,甩干 (也可轻拍将孔内液体拍干). 6. 依序每孔加底物溶液 90μl,酶标板加上覆膜 37℃避光显色(30 分钟内,此时肉眼可见标 准品的前 3-4 孔有明显的梯度兰色,后 3-4 孔梯度不明显,即可终止). 7. 依序每孔加终止溶液 50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色.终止液的加入顺序应尽量与 底物液的加入顺序相同. 为了保证实验结果的准确性, 底物反应时间到后应尽快加入终止液 . 8. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度(OD 值). 在加终止液后立即进行检测.

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