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图 3:水中添加25pg/ml抗生素HTLC/MS/MS色谱图
图 4:25pg/mL抗生素标准品HTLC/MS/MS色谱图
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液相色谱在线净化-电喷雾串联质谱测定水产品 中大环内酯和林可胺类药物残留
徐锦忠1*,储晓刚2,胡小钟3,丁涛1,吴斌1,沈崇钰1,蒋原1 (1. 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,江苏 南京,210001; 2. 中国检验检疫科学研究院,北京,100123; 3. 湖北出入境检验检疫局技术中心,武汉,430022)
摘 要:建立了水产品中大环内酯类抗生素[红霉素(ERM),罗红霉素(ROM),替米卡星(TIL),泰乐菌素 (TYL),北里霉素(KIT),交沙霉素(JOS),竹桃霉素(OLM),螺旋霉素Ⅰ(SPM-Ⅰ)和林可胺类(林可霉素 (LIN)和氯林可霉素(CLD))的高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测方法.样品经提取后,反相液相色 谱分离净化后进行质谱分析, 在选择反应监测模式(SRM) 下进行特征母-子离子对信号采集.根据保留时间和母离子及两个 特征子离子信息进行定性分析,以基峰离子进行定量.大环内酯类残留的检测限( S/N = 3) 为 0.1-0.2 μg/Kg,定量限为 1.0 μg/Kg,在1.0～200 ng/ mL时峰强度与质量浓度的线性关系良好( R2 > 0.99).在虾,鳗鱼和带鱼三种基质中1.0,2.0, 10.0 μg/kg三个添加水平下, 除个别药物外,药物的平均回收率范围为64 %～114 %,日内相对标准偏差小于11.7 %.结果 表明,该法简单,灵敏,特异性强,适用于各种水产品中大环内酯类残留的分析确证. 关键字:大环内酯类药物,水产品,残留,在线净化,LC-MS/MS
1.前言
大环内酯类抗生素(macrolide antibiotics ,MALs)是利用放线杆菌或小单孢菌生产的具有大环状内酯环的抗生素的总 称,对革兰氏阳性菌和支原体有较强的抑制能力.林可胺类药物(lincosamides)是具有抗革阳性需氧菌,和革兰阳性或阴性 厌氧菌活性的抗生素, 通常用于需氧及厌氧混合感染的治疗.随着更多MALs的出现和商品化,MALs已经广泛用于细菌性 和支原体感染的化学治疗[1,2].林可胺类药物常见的有林可霉素和氯林可霉素,氯林可霉素比林可霉素具有更高的活性. 由于食品中的药物或其代谢产物都会有独特的变异性反应,药物在体内蓄积达到一定的浓度,对消费者构成潜在威胁,许 多国家对食品大环内酯类药物设定了相应限量要求,要求每种药物的残留限量不超过10 μg/kg. 目前报道的检测大环内酯类和林可胺类的检测方法主要有高效液相色谱法[3,4],气/质联用法[2],液/质联用法(LC/ MS)[5-12].LC/MS是目前药物残留分析中理想方法,它既可用于残留的确证分析,又能作为一种通用的高效能测定方 法.有文献报道同时检测蜂蜜中泰乐菌素和林可霉素[13],但国内尚未见液/质联用法测定水产品中大环内酯类和林可胺类 药物残留的研究报道.固相萃取方法既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取,又可用于净化,浓缩或富集,是 目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术. 水产品是我国重要的出口农产品之一,也一直是各国对各种药物残留检测的重点产品.水产品的品种很多,实验中选 取典型的虾,淡水的鳗鱼和海水的带鱼研究.本实验中对水产品试样用乙腈提取后,浓缩后定容,正己烷脱脂净化,液相 色谱在线净化,串联质谱仪测定.方法简单快速,实用性强.
2.实验部分
2.1试剂和材料 二次去离子水,甲醇(色谱纯),正己烷(色谱纯).替米卡星,竹桃霉素,红霉素,罗红霉素,泰乐菌素,北里霉 素,螺旋霉素Ⅰ,交沙霉素,林可霉素和氯林可霉素标准物:购自sigma或Dr. E公司,纯度≥95% 药物标准储备溶液:1.0 mg/mL.准确称取适量的药物标准物质,用甲醇配成1.0 mg/mL的标准储备液.储备液储存在 4℃冰箱中,可使用六个月. 药物标准工作溶液:用空白样品提取液分别配成大环内酯类药物浓度为2 ng/mL 5 ng/mL,10 ng/mL,20 ng/mL,50
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ng/mL,100 ng/mL,200 ng/mL标准工作溶液,标准工作溶液在4℃保存,可使用两周. 2.2仪器 液质联用仪由Surveyor液相色谱系统和Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra 三重四极杆串联质谱[电喷雾电离源( ESI)] 构成.液相系统包括自动进样器(Autosampler 1.3),质谱泵(MS Pump 2.0)软件使用Xcalibur 1.4版.真空氮气吹干 仪( Zymark 公司,USA),Milli Q去离子水发生器(Millipore 公司,USA). 2.3试样的制备与保存 2.3.1试样的制备 取具有代表性的可食部分500 g,充分搅碎,混匀,密封,并做上标记,于-18℃冷冻保存.制样过程中,应防止样品 收到污染而发生残留物含量的变化. 2.3.2提取 准确称取水产品试样(5.00±0.05g),置于50 mL具塞离心管中,加入10 mL 乙腈,涡旋混匀后,室温下超声10 min,加入约5 g无水硫酸钠,涡旋后静置10 min.涡旋静置10min,8000 r/min离心5 min,将上层有机相转移至梨形瓶 中.再用10 mL乙腈重复提取一次,合并上层有机相.在40℃下,氮气吹至干.用1.0 mL3:7甲醇水溶液涡旋溶解残渣后再 加入和0.5 mL正己烷.溶液涡旋30 s后,16000 r/min离心5 min,取适量下层溶液经0.22 μm滤膜过滤后,供LC-MS/MS法 测定 2.3.3测定 液相色谱条件 色谱柱:Varian Polaris C18-A, 5 μm, 150 mm×2.1 mm i.d;流动相:0.1%甲酸水溶液 (A)+甲醇(B);流速:0.25 mL/min;梯度:0～3.0 min 10% ～ 60% B, 3.0～4.0 min 60% B, 4.0～8.0 min 600% ～ 90% B,8.0～11.0 min 90% B, 11.1～13.0 min 10% B;柱温:室温;进样量:25 μL. 串联四极杆质谱条件 离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:选择反应检测;电喷雾电压:-4500V;雾化气压力: 0.060 Mpa;气帘气压力:0.060 Mpa;辅助气流速:5 L/min;离子源温度:350℃;数据采集参数:Scan width: 0.002 amu; Scan time=0.02 s (Ms2). 在线切换阀:0-5.5 min 至废液,5.5-11.0 min 进质谱分析,11.0至废液.

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