浙江大学医学院生理科学综合实验论文
杜仲皮水提取物舒张大鼠离体胸主动脉环的作用及机制
作者:戴胜 合作者:方晶晶,陈赟,张丽,刘金炜 (浙江大学医学院 02 级临床医学三系 0203 班 2 组,3021831086) [摘 要] 目的:研究杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)对离体大鼠胸主动脉环收缩张力的作用及其 机制.方法:采用大鼠离体胸主动脉灌流模型,累积加药,检测杜仲对去氧肾上腺素(PE)和 KCL 预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响.结果:内皮完整时,杜仲皮水提取物(0.2,0.4,0.8,1.6,2.4, 3.2 mg/mL)对 PE(10-4mol/L)和 KCL(60mmol/L)预收缩的血管环均产生舒张作用(p＜0.01) ;而 用 NO 合酶(NOS)抑制剂 L-NAME(10-4mol/L),鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂 ODQ(10mol/L) 以及环氧酶(COX)抑制剂 Indo(10-5mol/L)处理血管后,杜仲皮水提取物的舒张血管效应均被阻断 (L-NAME:p＜0.05,ODQ: p＜0.01,Indo: p＜0.05).而用电压依赖性的 K+ 通道阻断剂 4-AP(1mmol/L),Ca2+ 敏感性的 K+ 通道阻断剂 TEA(1mmol/L)以及 ATP 敏感性的 K+ 通道阻断剂格列 苯脲(Glib)(3mol/L)处理后,对杜仲皮水提取物介导的内皮依赖性的舒血管效应阻断作用均不明显 (p>0.05).去内皮时,杜仲皮水提取物(0.2,0.4,0.8,1.6,2.4,3.2 mg/mL)对 PE(10-4mol/L)预 收缩的血管环舒张作用不显著(p>0.05) .结论:杜仲皮水提取物通过 NO-鸟苷酸环化酶途径和环氧 合酶途径两条通路使大鼠离体胸主动脉环产生内皮依赖性的舒张效应. [关键词] 杜仲;NO;胸主动脉环;内皮;血管舒张
aqueous extracts of Eucommia ulmoides Oliv. induced endothelium dependent relaxation of rat thoracic aorta
DAI Sheng ,FANG jing-jing,CHEN Yun,et al College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310003 [Abstract] Objective:To investigate the effect of aqueous extracts of Eucommia ulmoides Oliv. on rat thoracic aorta rings and the underlying mechanisms. Methods: The study was performed with the model of isolate rat thoracic aorta rings in organ bath, we investigate the effects of accumulated aqueous extracts of Eucommia ulmoides Oliv. on the constriction of high KCL and Phenylephrine(PE) preconstricted rat thoracic aorta with or without endothelium. Results: Aqueous extracts isolated from eucommia bark (B) (0.2, 0.4, 0.8,1.6,2.4,3.2 mg/mL) concentration dependently caused endothelium-dependent relaxation in vessels precontracted both with 10-4mol/L phenylephrine (PE) and 60mmol/L KCL, but it had no effect. on de-endothelialized vessels precontracted with PE. The endothelium-dependent relaxation evoked by B was either abolished or substantially inhibited by 10-4mol/L NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), 10mol/L guanyly cyclase inhibitor 1H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-alpha] quinoxalin-1-one (ODQ) and 10-5mol/L Indomethacin (Indo) indicating the involvement of the nitric oxide (NO) synthase pathway in the , vasorelaxant action of B. The relaxation to the aqueous extract of eucommia bark was not inhibited by 1mmol/L tetraethylammonium (TEA) , 1mmol/L 4-aminopyridine(4-AP)and 3mol/L Glibenclamide (Glib). This suggests that the endothelium-dependent, NO-mediated relaxation evoked by the aqueous eucommia extracts may not involve the activation of K+ -channels. Conclusion:The results incated that aqueous extracts of Eucommia ulmoides Oliv.can relax the rat thoracic aorta rings with endothelium-dependent . The mechanism may include the activation of NO-GC pathway and COX pathway in vascular endothelium cells. [Key Words] Eucommia ulmoides Oliv. ; NO; thoracic aorta rings; endothelium; vascular relaxation
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浙江大学医学院生理科学综合实验论文 杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.;Du-zhong) 是传统中药, 祖国医学认为其具有补肝肾, 强筋骨, [1] 安胎之功效 .杜仲的化学成分复杂,主要含木脂 素类,环烯醚萜苷类,挥发油,多糖,氨基酸,有 机酸,甾醇,磷脂,维生素,微量元素以及硬性胶 等,其中以木脂素类和环烯醚萜苷类研究为多 [2] . 杜仲的药理作用非常广泛,能抗炎,抗病毒,调节 免疫,对多种疾病有很高的价值,尤其在治疗高血 压方面,杜仲被认为是现在世界最高质量的无副作 用的天然降压药物.过去的研究认为其降压的主要 成分是松脂醇二葡萄糖苷.[3] 虽然杜仲具有舒张血 管降低血压的作用,然而其对离体血管的作用机制 尚未十分了解,因此本实验在大鼠离体胸主动脉环 灌流模型的基础上,通过观察杜仲皮提取物对内皮 完整和去除内皮的血管环张力的影响,探讨其对血 管平滑肌的作用及可能的机制. 1 材料与方法 30min,每隔15min换一次K-H液,此后调节静息张 力为2g,稳定稳定1h,期间每隔15min换一次K-H 液.用3M的KCL重复刺激3次,以诱发血管的最大 收缩幅度.待血管稳定后,用10-4 mol/L PE预收缩 血管环达峰值,加入10-3 mol/L Ach检验内皮的完整 性.加入Ach后使PE预收缩的血管环舒张60%~90 %,认为内皮完整,反之,认为内皮被破坏. 实验用 RM6240B 型生物信号采集处理系统记 录血管张力的变化, 分别以末次 KCL (终浓度 6×10-2 mol/L) ,PE(终浓度 10-8 mol/L)刺激引起的最大 收缩幅度为标准,以加入药物后的血管张力幅度与 之相比所得百分比比值表示. 1.4 实验分组 1.4.1 累积浓度杜仲水提取液对 PE 预收缩内皮完 整的血管环的作用(有内皮组) :实验组(n=7) , -4 用 PE(10 mol/L)预收缩血管,达稳定后用累积加 药法,以每 15min 加杜仲水提取液一次,使灌流液 中的杜仲提取物终浓度分别达 0.2,0.4,0.8,1.6, 2.4,3.2(mg/mL) ,观察杜仲提取物对对 PE 预收 缩内皮完整的血管环的作用. 1.4.2 累积浓度杜仲水提取液对 PE 预收缩去内皮 的血管环的作用(去内皮组) :实验组(n=7) ,用 -4 PE(10 mol/L)预收缩血管,达稳定后用累积加药 法,以每 15min 加杜仲水提取液一次,使灌流液中 的杜仲提取物终浓度分别达 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 2.4, 3.2 (mg/mL) 观察杜仲提取物对 PE 预收缩去除内 , 皮的血管环的作用. 1.4.3 累积浓度杜仲水提取液对 KCL 预收缩内皮 完整的血管环的作用(KCL 组) :实验组(n=6) , 用 KCL(60mmol/L)预收缩血管,达稳定后用累 积加药法,以每 15min 加杜仲水提取液一次,使灌 流液中的杜仲提取物终浓度分别达 0.2,0.4,0.8, 1.6,2.4,3.2(mg/mL) ,观察杜仲提取物对 KCL 预收缩内皮完整的血管环的作用. 1.4.4 L-NAME 对 杜 仲 谁 提 取 物 作 用 影 响 组 (L-NAME 组) :实验组(n=8) ,内皮完整的血管 -4 环用 10 mol/L L-NAME 预处理 15min 后,再用 PE (10-4mol/L) 预收缩血管, 达稳定后用累积加药法, 以每 15min 加杜仲水提取液一次,使灌流液中的杜 仲提取物终浓度分别达 0.2,0.4,0.8,1.6,2.4, 3.2(mg/mL) ,观察 L-NAME 预处理后杜仲提取物 对 PE 预收缩内皮完整的血管环的作用. 1.4.5 Indo 对杜仲谁提取物作用影响组 (Indo 组) : -5 实验组 (n=6) 内皮完整的血管环用 10 mol/L Indo , 预处理 15min 后,再用 PE(10-4mol/L)预收缩血 管,达稳定后用累积加药法,以每 15min 加杜仲水
1.1 设备 离体血管环灌流装置,JZJ01 型肌肉张 力换能器,HSS-1B 型数字式超级恒温浴槽, RM6240B 型多道生理信号采集处理系统,均为成 都仪器厂产品. 1.2 药物与试剂 苯肾上腺素(Phenylephrine, PE) ,乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach) ,左旋硝基精 氨 酸 甲 脂 ( N ( omega ) -nitro-L-methyl-ester , L-NAME ) 吲 哚 美 辛 ( Indomethacin , Indo ) , , 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one (ODQ), 格列苯脲 (Glibenclamide) 以上均为 Sigma , 公司产品,杜仲皮水提取物由浙江大学药学院提 取,用 K-H 液配制含杜仲提取物 20mg/ml 的原液. Krebs-Henseleit (K-H) (mmol/L) NaCL 118, 液 : KH KCL 4.7, 2PO4 1.2, MgSO4 7H2O 1.2, NaHCO3 25,glucose 10,CaCL2 1.25. 1.3 血管环的制备 Sprague-Dawley(SD)大鼠, 雄性,体重 200-280 g,由浙江大学医学院动物实 验中心提供.每个大鼠的胸主动脉被分成 6 段,并 随机分入 6 个实验组进行平行研究. 具体方法为:用钝器击昏大鼠后充分放血,迅 速取胸主动脉, 置于通以95%O2和5%CO2混合气体 预饱和地4°C K-H液中, 去除周围结缔组织后将血管 剪成约3~4mm的血管环,避免过度牵拉,以防损伤 内皮.根据实验需要,去除血管内皮时,用镊子磨 擦血管环内表面以去除内皮细胞.将血管环悬挂于 预置10ml K-H液的浴槽内,37°C恒温,持续通以95 %O2和5%CO2的混合气体.静息张力0g稳定血管
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浙江大学医学院生理科学综合实验论文 提取液一次,使灌流液中的杜仲提取物终浓度分别 达 0.2,0.4,0.8,1.6,2.4,3.2(mg/mL) ,观察 Indo 预处理后杜仲提取物对 PE 预收缩内皮完整的血管 环的作用. 1.4.6 格列苯脲(Glib)对杜仲谁提取物作用影响 组(格列苯脲组) :实验组(n=6) ,内皮完整的血 管环用 3mol/L 格列苯脲预处理 15min 后, 再用 PE -4 (10 mol/L) 预收缩血管, 达稳定后用累积加药法, 以每 15min 加杜仲水提取液一次,使灌流液中的杜 仲提取物终浓度分别达 0.2,0.4,0.8,1.6,2.4, 3.2(mg/mL) ,观察格列苯脲预处理后杜仲提取物 对 PE 预收缩内皮完整的血管环的作用. 1.4.7 ODQ 对杜仲谁提取物作用影响组(ODQ 组) 实验组(n=7) 内皮完整的血管环用 : , 10mol/LODQ 预处理 15min 后, 再用 PE -4mol/L) (10 预收缩血管,达稳定后用累积加药法,以每 15min 加杜仲水提取液一次,使灌流液中的杜仲提取物终 浓度分别达 0.2,0.4,0.8,1.6,2.4,3.2(mg/mL) , 观察 ODQ 预处理后杜仲提取物对 PE 预收缩内皮完 整的血管环的作用. 1.4.8 4-AP 对杜仲谁提取物作用影响组(4-AP 组) 实验组(n=6) 内皮完整的血管环用 : , 1mmol/L4-AP 预处理 15min 后, 再用 PE (10-4mol/L) 预收缩血管,达稳定后用累积加药法,以每 15min 加杜仲水提取液一次,使灌流液中的杜仲提取物终 浓度分别达 0.2,0.4,0.8,1.6,2.4,3.2(mg/mL) , 观察 4-AP 预处理后杜仲提取物对 PE 预收缩内皮完 整的血管环的作用. 1.4.9 TEA 对杜仲谁提取物作用影响组 (TEA 组) : 实验组 (n=5) 内皮完整的血管环用 1mmol/L4-AP , 预处理 15min 后,再用 PE(10-4mol/L)预收缩血 管,达稳定后用累积加药法,以每 15min 加杜仲水 提取液一次,使灌流液中的杜仲提取物终浓度分别 达 0.2,0.4,0.8,1.6,2.4,3.2(mg/mL) ,观察 TEA 预处理后杜仲提取物对 PE 预收缩内皮完整的 血管环的作用. 1.4.10 杜仲水提取物舒血管作用的时间效应组(效 应组) :实验组(n=4) ,内皮完整的血管环用 PE -4 (10 mol/L)预收缩血管,达稳定后一次性加药, 使灌流液中的杜仲提取物终浓度达 3.2(mg/mL) , 每隔 2min 记录一次血管环的张力,观察杜仲提取 物对 PE 预收缩内皮完整的血管环作用的时间效应. 1.5 统计处理 试验结果用 X ±s 表示, Microsoft 用 Excel 软件处理,两组间比较采用 t 检验,多组间比 较采用 ANOVA 法进行显著性检验,p<0.05 认为有 显著性差异.
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2 结果 2.1 杜仲皮水提取物对PE预收缩的主动脉环张力 的影响 如图 1 所示, 可使如图 1 所示, 杜仲皮水提取物 可使 PE 预收缩的内皮完整主动脉环舒张, PE 预 与 收缩时的最大张力比较,血管张力明显降低 (##p<0.01) .且呈剂量依赖性.杜仲皮水提取物对 PE 预收缩去内皮动脉环血管张力的影响显著小于 对内皮完整血管的影响(* p<0.05) ,不能很好地舒 张去内皮的血管环. 杜仲皮水提取物(mg/mL)
-E +E +E
杜仲皮水提取物浓度: (1:0.2,2:0.4,3:0.8,4: 1.6,5:2.4,6:3.2) (mg/mL)
B
图 1. 杜仲皮水提取物对 PE 预收缩的主动脉环张力的影响 Fig.1 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat. A: Records from experiments illustrating the effect of increasing dose of Eucommia on the tension of PE precontracted aorta rings with(right,+E)or without(underside,-E)endothelium. B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings with or whithout endothelium. ##p< 0.01compared with predrug compare PE(+E) with
* value (concentration 0)p<0.05
PE(-E) .
浙江大学医学院生理科学综合实验论文 2.2 杜仲皮水提取物对KCL预收缩的主动脉环张 力的影响 为了观察杜仲皮水提取物是否对KCL诱导的 血管收缩作用有影响,用60mmol/L的KCL收缩血 管.结果表明,杜仲对KCl预收缩主动脉环张力有 显著的舒张作用(##p<0.01) ,在杜仲浓度达到 3.2mg/ml时PE组和KCl组有显著差异(*p0.05)(如 . 图2) B
图 3 杜仲皮水提取物对 L-NAME 处理主动脉环张力的影响 Fig 3. Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by L-NAME. A: Records from experiments illustrating the effect of Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by L-NAME. B:Pooled data of mean normalized
##
vessel
tension
obtained
form
PE value
precontracted aorta rings(pretreated by L-NAME) with endothelium. 图 2 杜仲皮水提取物对 KCl 预收缩主动脉环张力的影响 Fig.2 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of KCl precontracted aorta rings of rat. Pooled data of mean normalized vessel tension obtained from KCl precontracted and PE precontracted aorta rings with endothelium .*p<0.05 compared with PE(+E)group, ##p<0.01 compared with predrug value (concentration 0). p < 0.01 compared with predrug
#
(concentration 0) p<0.05 compare PE(+E)group with , L-NAME+PE(+E)group.
2.3 杜仲皮水提取物对PE预收缩L-NAME的主动 脉环张力的影响 为了探讨NO-GC途径是否参与杜仲皮水提取 物的血管舒张作用, 用NO抑制剂L-NAME处理内皮 完整的血管环后,观察杜仲皮水提取物对血管张力 的影响.L-NAME预处理后,L-NAME自身对PE诱 导的血管张力无明显影响,但杜仲皮水提取物对PE 预收缩的血管产生的舒张作用被抑制(图3) .
2.4 杜仲皮水提取物对PE预收缩Indo处理的主动 脉环张力的影响 为了探讨环氧合酶(COX)途径是否参与杜仲 皮水提取物的血管舒张作用,采用内皮完整的血管 环用环氧合酶抑制剂 Indo 处理后, 观察杜仲皮水提 取物对血管张力的影响.Indo 预处理后,杜仲皮水 提取物对 PE 预收缩的血管产生的舒张作用被减弱 (#p<0.05) ,但 Indo 处理自身对 PE 诱导的血管张 力无明显影响(图 4) . A
B
A
+E
图 4 杜仲皮水提取物对 Indo 预处理主动脉环张力的影响 -4-
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Fig. 4 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by Indo. A: Records from experiments illustrating the effect of Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by I. B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by indomethacin) with endothelium.#p0.05) 且 TEA 处理自身对 PE 诱导的 , 血管张力无明显影响.
2.5 杜仲皮水提取物对PE预收缩ODQ处理的主 动脉环张力的影响 为了探讨鸟苷酸环化酶途径是否参与杜仲皮水 提取物的血管舒张作用,用鸟苷酸环化酶抑制剂 ODQ 处理内皮完整的血管环后, 观察杜仲皮水提取 物对血管张力的影响. ODQ 预处理后, 杜仲皮水提 取物对 PE 预收缩的血管产生的舒张作用显著减弱 (##p<0.01) ,但 ODQ 自身对 PE 诱导的血管张力 无明显影响.
A
B
A
图 6 杜仲皮水提取物对四乙胺(TEA)预处理主动脉环张 力的影响 Fig. 6 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by TEA. A: Records from experiments illustrating the effect of Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by TEA.B: Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by TEA) with endothelium. p ＞ 0.05compare PE(+E)group with TEA+PE(+E)group. 图 5 杜仲皮水提取物对 ODQ 预处理主动脉环张力的影响 Fig. 5 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by ODQ. A: Records from experiments illustrating the effect of Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by ODQ.B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by ODQ) with endothelium. ##p0.05) ,且格列本脲(Gli)处 理自身对 PE 诱导的血管张力无明显影响.
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2.6
杜仲皮水提取物对PE预收缩TEA处理的主动
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图 8 杜仲水提液对 4-AP 预处理主动脉环张力的影响
A
Fig.8 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by 4-aminopyridine(4-AP). A: Records form experiments illustrating the effect of Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by 4-AP. B: Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by 4-AP ) with endothelium.
B
图 7 杜仲皮水提取物对 Glib 预处理主动脉环张力的影响 Fig. 7 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by Glib A: Records from experiments illustrating the effect of Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by Glib. B: Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by Glib with endothelium.
2.8 杜仲皮水提取物对PE预收缩内皮完整主动脉 环舒张作用的时间效应 为了研究杜仲内皮依赖性舒张血管作用的时 间效应,在加药后每隔2min测量一次,可以从时间 效应曲线中看出杜仲对有内皮血管的舒张度在加 药7min内基本上与时间呈线性相关,而且斜率比较 大.在继后的时间内,杜仲舒张血管的幅度减小. (见图9)
2.8 杜仲皮水提取物对PE预收缩4-PA处理的主 动脉环张力的影响 为了研究杜仲皮水提取物的血管舒张作用是 + + 否通过电压门控 K 通道发挥作用,用电压门控 K 通道阻断剂 4-AP 处理内皮完整的血管环后,观察 杜仲皮水提取物的血管效应. 4-AP 处理后, 杜仲皮 水提取物对 PE 预收缩血管的舒张作用未被明显减 弱(p>0.05) ,且 4-aminopyridine(4-AP)处理自身对 PE 诱导的血管张力无明显影响. A
图 9 杜仲皮水提取物对 PE 预收缩内皮完整主动脉环舒张 作用的时间效应 Fig.8 The time dependent effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat.
3
讨论
B
杜仲是一种常见中药,具有抗炎抗病毒,降血 压,抗肿瘤等作用,其中降压作用尤其显著 [1] .杜 仲皮的主要降压成分为松脂醇二葡萄糖苷[3] .根据 以往大鼠活体实验报道,杜仲皮中分离出的木脂素 类和环烯醚萜苷类的水溶性提取物能降低大鼠血 压,并呈剂量依赖性[1] .也有报道杜仲叶中所含的 iriodendrln, asperoslde 和 syrlngln 为血管紧张 素和 cAMP 的抑制剂,起舒张血管作用[2].最近又有 文献报道杜仲皮和叶的水提取物对大鼠的胸主动
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浙江大学医学院生理科学综合实验论文 脉环有舒张作用,且呈内皮依赖性 . 本实验研究结果表明,杜仲皮水提取物可使 PE 及 KCL 预收缩的大鼠胸主动脉环产生内皮依赖性 的舒张,这与 Chiu-Yin Kwan 等的研究结果是一致 的.试验结果还显示,用 NO 合酶(NOS)抑制剂 L-NAME 和鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂 ODQ 均能 阻断杜仲皮水提取物的舒张血管效应.试验还发 现,环氧酶(COX)抑制剂 Indo 处理血管后,杜仲 皮水提取物的舒张血管效应也被阻断.但用电压依 赖性的 K+ 通道阻断剂 4-AP,Ca2+ 敏感性的 K+ 通 道阻断剂 TEA 以及 ATP 敏感性的 K+ 通道阻断剂格 列苯脲处理后,对杜仲皮水提取物介导的内皮依赖 性的舒血管效应阻断作用均不明显.这些结果提示 我们 NO-GC 途径和 COX 途径可能共同参与杜仲 皮水提取物的舒血管作用,而各种 K+ 通道与之关 系并不密切. 本研究表明:杜仲皮水提取物可使 PE 及 KCL 预收缩的大鼠胸主动脉环产生内皮依赖性的舒张, 虽然两者的机制不同. KCL 通过是平滑肌细胞去极 化而诱导血管收缩,其机制主要是细胞外高 K+ 使 Ca2+ 通道开放,细胞外 Ca2+ 内流,从而增加了细 胞内 Ca2+的浓度[5].然而,PE 诱导的血管收缩是由 α1 肾上腺素受体的激活造成的, 主要通过激活磷脂 酶 C(PLC) ,产生甘油二酯(diacylglycerol,DG) 和三磷酸肌醇 (1, 5-triphosphate inositol, 3) 4, IP , 2+ [6] 主要通过 IP3 诱导肌浆网内的 Ca 释放 .尽管机 制不同,但最终结果是相同的,即细胞内 Ca2+浓度 升高,促进血管平滑肌细胞肌凝蛋白和肌纤蛋白的 相互作用,从而引起收缩.杜仲皮水提取物对两者 诱导的内皮完整的血管环产生舒张作用,这可能提 示了杜仲皮水提取物通过某些机制影响内钙的释 放和和 Ca2+通道开放来产生舒张血管的作用,其详 细机制还需进一步研究. 杜仲皮水提取物的舒张血管作用是呈内皮依赖 性的.内皮细胞通过释放血管舒张物质在在调节平 , , 滑肌的张力中起到了重要的作用[5 7 8].内皮细胞 中释放的最重要的一种物质是内皮源性舒张因子 (Endithelium-derived relaxing factor,EDRF) ,已 [8] 被 Furchgott 等确认是 NO .其它舒血管物质还有 前列环素(PGI2)等.基础状态下血管内皮细胞可 以持续释放 NO,这在维持血管静息张力中起了重 要的作用[9].NO 作为一种强烈的内皮源性血管舒 张因子,其输血管机制如下:血管内皮细胞中内皮 型 NO 合酶(eNOS)催化生成 NO 后,其可透过细 胞膜扩散进入平滑肌细胞,并且与平滑肌细胞那的 可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)血红素部分结合,活
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化 sGC, Mg2+与 ATP 存在的条件下活化的 sGC 在 催化 GTP 形成 cGMP, 后者作为一种重要的信号分 子可激活 cGMP 依赖的蛋白激酶(PKG) ,活化的 2+ PKG 使平滑肌细胞膜 L 型 Ca 通道(ICa,L) ,肌浆 网(SR)膜的 IP3 受体和 rya-nodine 受体磷酸化, 磷酸化可以使这些通道失活,关闭,前者使 Ca2 内 流减少,而后者使 SR 释放 Ca2 减少,两者都使平 滑肌细胞内的 Ca2 减少,诱发血管平滑肌的舒张[8]. 通过激活 NOS 能促进 NO 的合成, 可产生多种生物 学效应,包括血管反应性和降低血压等[5].在本实 验中,NOS 抑制剂 L-NAME 阻断了杜仲皮水提取 物引起的舒血管作用,这可能是杜仲皮水提取物通 过 NO 途 径 介 导 血 管 舒 张 效 应 , 而 该 作 用 被 L-NAME 通过阻断 NOS 所抑制了.此外,GC 阻断 剂 ODQ 也可以阻断杜仲皮水提取物的内皮依赖性 舒血管作用.这可能是由于 ODQ 作用于 GC 使 cGMP 合成受阻,从而使 NO-GC 通路被阻断[10].. 因此结合以往研究和本实验结果,我们可以推论 NO-GC 途径可能参与了杜仲皮水提取物的内皮依 赖性舒张血管作用. 本实验还发现用 COX 抑制剂 Indo 也可以阻断 杜仲皮水提取物的舒张血管作用,这可能提示了除 NO-GC 途径外, 杜仲皮水提取物还可以通过另外一 条途径-COX 途径介导内皮依赖性的血管舒张作 用.这可能是其作用于内皮细胞,使 COX 活性增 强, 2 合成增多, 2 介导了血管的舒张[11]. PGI PGI Indo 通过抑制 COX 使 PGI2 合成减少,所以如实验结果 所示,Indo 处理后,杜仲皮水提取物的舒血管作用 被阻断. K+ 通道是血管平滑肌细胞最主要的离子通道 之一,NO-GC 途径中的 PKG 可以促进 K+ 通道的 , 开放,加速细胞复极,抑制 Ca2+内流[12 13],从而产 , , 生舒血管作用[12 13 14].杜仲皮水提取物是否可能 通过影响 K+ 通道而产生舒血管效应呢 实验结果 表明:电压依赖性的 K+ 通道阻断剂 4-AP,Ca2+ 敏 感性的 K+ 通道阻断剂 TEA 以及 ATP 敏感性的 K+ 通道阻断剂格列苯脲处理后对杜仲皮水提取物介 导的内皮依赖性的舒血管效应阻断作用均不明显. 因而不能肯定 K+ 通道是否参与了杜仲皮水提取物 介导的内皮依赖性的舒血管过程,有待于进一步研 究证明. 总之,杜仲皮水提取物对大鼠离体胸主动脉环 具有内皮的依赖性的舒张作用.其机制可能是作用 于血管内皮细胞上的 NO-GC 途径和 COX 途径这两 条通路,导致内皮依赖性的舒血管因子 NO 和 PGI2 合成增多,最终引起血管的舒张.但其详细机制还
浙江大学医学院生理科学综合实验论文 有待于进一步研究. References: [1] 胡佳玲.杜仲研究进展.中草药,1999,30(5):394-396 [2] 胡世林.国外研究杜仲的某些进展与动向.国外医学中医中药分册,16(5):13,14 [3] 郝武富,中国中药研究,1996,21(7) :411 [4] Chiu-Yin Kwan et. al. Endothelium-dependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv. leaf and bark: implications on their antihypertensive action. Vascular Pharmacology 40 (2004): 229– 235 [5] 曹春梅, 叶松, 俞虎, 等, 白细胞介素!" 引起离体大鼠主动脉环舒张及其作用机制, 生理学报, 2003, 55(1):19-23 [6] 张必祺,胡申江,单绮娴,等,JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY (MEDICAL SIENCES)(浙江 大学学报(医学版) )2005,34(1) :68 [7] Moncada S,Palmer RM,Higgs EA,Nitric oxide:physiology,pathophysiology,and pharmacology. Pharmacol Rev 1991;43;109-142 [8] Furchgott RF,Vanhoutte PM,Endothelium-dependent factors,FASEB,1989;3;2007-2018 [9] 朱妙章等,心血管生理学与临床,北京:高等教育出版社,2004:263-265,274,282-285 [10] Changhua Wang et al,Decreased aortic smooth muscle contraction in a rat model of multibacterial sepsis, Blackwell Publishing Fundamental & Clinical Pharmacology 18 (2004) 679–683 [11] 杨世杰等,药理学,北京:人民卫生出版社,2003:272,273 [12] 韦耿泽,朱运龙,于军,等,17-β雌二醇对大鼠胸主动脉的舒张作用及其机制的研究,医学研究生 学报,2003:16(12),896 [13] Mendelsohn MF, Abras RH, protectiv effects of estrogen on the cardiovascular system[J], Engl J Med The N 1999:340(23) ,1801-1811 [14] Linoln TM, Dey N, Sellak H, cGMP-dependent protein kinase signaling mechanisms in smootn muscle from the regulation of tone to gene expression[J],J Appl Physiol,2001:91(3) ,1421-1430
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