中国农业科学 2010,43(1):1-11 Scientia Agricultura Sinica
doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.01.001
水稻胚乳贮藏物代谢相关基因响应花后高温胁迫 的微阵列分析
韦克苏,程方民,董海涛,张其芳,刘奎刚,曹珍珍
(浙江大学农业与生物技术学院,杭州 310029)
摘要: 【目的】揭示花后高温条件下水稻灌浆过程中胚乳淀粉和蛋白贮藏物代谢相关基因的表达谱,并阐明 部分重要功能基因对花后高温胁迫的响应表达模式.【方法】利用人工气候箱设高温(日均温度 32℃,日最高温 36℃/日最低温 28℃)和适温(日均温度 22℃,日最高温 26℃/日最低温 18℃)2 个温度处理,并在水稻开花后 的不同时期取样, 对水稻胚乳贮藏物代谢各类相关基因的表达谱与表达模式进行高通量的 cDNA 微阵列检测.【结 果】在水稻胚乳贮藏物代谢的相关基因中,以对高温胁迫响应表现较迟钝的基因居多,其高温处理与低温处理之 间的杂交信号(nARVOL)比值(称 R 值)大致在 0.8—1.2,但随高温处理时间的持续,呈上调或下调差异表达的 基因数量均有明显增加;花后高温对胚乳糖代谢和淀粉合成类基因表达的调控效应,不仅随各个基因的功能类型, 代谢途径和灌浆进程的差别变化而异,而且其表达丰度及其上调或下调幅度在很大程度上还与该功能基因的同工 型(或酶亚基)有关;高温处理下水稻胚乳中的谷蛋白,醇溶蛋白和球蛋白类基因多呈下调表达特征, 但也会随 其所调控的蛋白亚基组分的不同而异,从而对胚乳贮藏蛋白的亚基构成和组分变化产生较大影响;与胚乳白贮藏 物代谢密切相关的糖信号传导类基因,核糖体蛋白类基因和逆境防御蛋白类基因普遍比直接参与胚乳贮藏物合成 路径的功能基因对高温胁迫响应表现敏感.【结论】花后高温胁迫对水稻胚乳灌浆贮藏物代谢的调控相当复杂, 涉及到众多的功能基因位点. 关键词:水稻;高温;基因表达;cDNA 微阵列;胚乳贮藏物代谢
Microarray Analysis of Gene Expression Profile Related to Grain Storage Metabolism in Rice Endosperms as Affected by High Temperature at Filling Stage
WEI Ke-su, CHENG Fang-min, DONG Hai-tao, ZHANG Qi-fang, LIU Kui-gang, CAO Zhen-zhen
(College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029)
Abstract: 【Objective】 Effects of high temperature after rice flowering stage on the expression profile and their patterns of mass genes related to grain storage metabolism were clarified. 【Method】 A cDNA array of 3574 unigenes containing was used for the detection of different filling grain samples and the controlled temperature treatments were conducted in growth chambers, with the daily mean temperature being controlled at 32℃(36℃/28℃) and 22℃(26℃/18℃) for high and moderate temperatures, respectively. 【Result】 The expression levels of majority genes were not sensitive to high temperature treatment among 657-673 candidate genes, with their R value (the ratio of gene hybridized signal between two temperature treatments) ranging from 0.8 to 1.2. However, the different expression genes (up-regulation or down-regulation) increased remarkably when rice plants were consistently exposed to high temperature treatment. There was a considerable difference in gene expression patterns of grain starch synthesis and carbohydrate metabolism induced by high temperature treatment after flowering stage, varied greatly with different gene function classification, metabolizing pathway, iso-form types (or subunit) and also filling stage, in which such genes imposing sugar signal
收稿日期:2009-03-30;接受日期:2009-05-14 基金项目:国家自然科学基金项目(30671228 和 30871488) ,教育部高校博士学科点专项科研基金(20070335104) 作者简介:韦克苏,博士研究生.E-mail:wks132117205@163.com.通信作者程方民,教授,博士.Tel:0571-86940446;E-mail:chengfm@zju.edu.cn
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function, with much wide variation in expression levels between two temperature treatment, were more sensitive to high temperature than those genes in relation with grain starch synthesis and other carbohydrate metabolism. The expressing response of storage protein genes to high temperature was mostly down-regulation, despite different patterns for some protein subunit. For all genes related to grain protein synthesis metabolism, these genes impacting ribosomal protein and defense protein synthesis were mostly sensitive to different temperature treatments or strongly-high specific expression induced by high temperature at filling stage. 【Conclusion】 There is a complex regulating network existing in the effects of high temperature stress on mass genes related to grain storage metabolism, with many genes being probably regulated by high temperature. Key words: rice (Oryza sativa L.); high temperature; gene expression; cDNA-microarray; grain storage metabolism
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引言
【研究意义】高温热害是影响水稻生产的主要逆
研究切入点】胚乳发育和充实过程是与水稻产量形成 和品质表现最为密切的一个生理环节,同时也是光合 同化产物的最终储藏场所[13-14].其中,胚乳的结构与 成分是稻米外观,口感,营养等品质指标的决定因素 之一[3].为此,本文通过在水稻开花后的动态取样, 利用高通量的 cDNA 微阵列芯片对不同温度处理下水 稻胚乳贮藏物代谢相关基因的表达丰度变化及其表达 谱进行了检测分析.【拟解决的关键问题】鉴于灌浆 结实期日平均气温 21—23℃时通常是水稻品质形成 的最适温度,而当日平均气温超过 26℃,优质稻米的 优质种性就很难得到充分发 挥[10].本文以优质早籼 品种嘉早 935 为材料,利用人工气候箱设高温(日均 温度 32℃, 日最高温 36℃/日最低温 28℃) 和适温 (日 均温度 22℃,日最高温 26℃/日最低温 18℃)2 个温 度处理,拟通过对水稻胚乳贮藏物代谢诸多相关基因 在不同温度处理下表达变化的全方位分析,揭示高温 胁迫对稻米品质影响效应与水稻胚乳贮藏物代谢相关 基因表达特征间的可能联系,为进一步开展稻米品质 改良工作中的"温钝"基因资源筛选与生理调控研究 提供理论参考.
境之一.水稻在高温条件下灌浆结实,一方面会致使 稻株衰老加速,灌浆期缩短,秕谷粒增多,产量明显 下降[1-2];另一方面,还会引起米粒垩白化程度增加, 整精米率降低,稻米食味品质变劣
[3-4]
.在中国长江中
下游地区,双季早稻的灌浆结实期或部分单季中稻的 抽穗扬花期正值盛夏或初秋,日平均温度较长时间维 持在 28℃以上, 甚至会出现日最高温度 38—40℃的极 端高温气候
[5-6]
, 不仅严重地制约着双季早稻的品质表
现,而且对单季水稻产量和品质的生态稳定性也带来 了较大的不利影响, 成为目前中国水稻生产实现持续, 稳步发展的一个重要制约因素 .因此加强水稻耐热 性的遗传与生理研究,探讨花后高温条件下水稻灌浆 过程中胚乳贮藏代谢相关基因的表达背景,对于通过 分子标记辅助育种或相关基因调控等手段解决上述生 态问题具有重要的理论指导意义.【前人研究进展】 针对花后高温对水稻灌浆及产量与品质形成影响的生 理原因,国内外不少学者曾利用人工气候箱控温或大 田异季种植等试验,对不同温度处理下水稻叶片光合 速率,茎鞘同化产物转运,根系活力和籽粒淀粉合成 代谢等生理生化变化做过大量研究报道[4,7-10].现已基 本明确,高温胁迫对水稻籽粒灌浆充实过程和稻米垩 白等品质性状的影响效应,与高温胁迫下水稻籽粒灌 浆速率加快 ,光合效率下降 ,膜系统机能损伤 , 茎鞘物质转运受阻 , 胚乳细胞相关 根系活力降低 , 酶的生理活性变化
[10] [8] [9] [3] [4] [7] [5]
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材料与方法
试验于 2008 年在浙江大学教学实验农场进行. 供
1.1 试验材料 试材料为早籼稻品种嘉早 935.3 月 31 日播种,湿润 育秧,5 月 2 日移栽,田间常规管理,及时防治病虫 杂草.待水稻在田间生长至孕穗后期,选取发育进程 与长势基本一致的稻株 20 株,带泥移入盆钵培育 7—10 d.之后,在盆钵中的稻株齐穗时,选同日开花 且发育良好的单穗进行挂牌标记,并分别移入不同温 度处理的气候箱中,分别在开花后的第 5 天,第 10 天,第 15 天和第 20 天(早籼稻灌浆的关键时期)取 样,每次取 2—3 个稻穗,-70℃保存备用. 1.2 人工气候箱控温处理
等生理因素均存在着一定联系.
但对于花后高温胁迫下水稻产量,品质形成的分子生 态机理,尤其是有关生理指标变化的基因表达背景, 以往研究工作仅局限于少数几个功能基因的 Northern 印迹杂交等方面[11-12],而对水稻籽粒灌浆过程诸多相 关基因在不同温度处理下的表达谱差异及其动态变化 特征,迄今尚缺乏较全面,较深入地研究分析.【本
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使用两台 CONVIRON 人工气候箱,日均温度分 别为 32℃ (高温处理, HT) 22℃ 和 (适温处理, LT) , 温度日变化模拟自然气候特征,24 h 连续运转,按文 献[12]设定程序自动控制.其中,高温处理时的最高 温度和最低温度分别为 36℃和 28℃, 适温处理时的最 高温度和最低温度分别为 26℃和 18℃, 日最大温差均 为 8℃.两台气候箱中的其它气候因子均保持完全一 致.其中,光照时间为 6:00-19:00,光照强度为 100—120 Jm s ,相对湿度为 75%—80%,风速 0.5 ms . 1.3 总 RNA 提取与同位素探针标记 对上述不同处理,不同时期采集的稻穗样品,取 着生在稻穗中上部的水稻籽粒 20 粒(重复 2 次),去 壳,剔胚后,对胚乳中的总 RNA 进行提取.RNA 的 抽 提 按 TRIZOL 试 剂 说 明 书 进 行 , 并 按 SUPERSCRIPTTMⅡ反转录试剂盒操作程序将总 RNA 逆转录为 cDNA 第一链, 使用 α- P-dCTP 渗入法标记 探针.探针经 G-50 柱纯化后在微阵列杂交前于 70℃ 下热变性 5 min,冰上迅速冷却待用.其中,RNA 抽 提 试 剂 TRIZOL
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空白代替. 1.5 微阵列杂交和数据提取 点制后的尼龙膜经 UV 交联后, Sambrook 等[15] 按 的方法进行预杂交,杂交和洗膜.以磷屏(Kodak) 压膜 48 h 后,Typhoon 8600(Molecular Dynamics)扫 描磷屏获杂交结果,以软件 ArrayVision 5.1 对扫描结 果进行定量分析.各点的信号强度由网圈包含的像素 灰度值 ARVOL 扣除其背景本底 BKgd 确定.之后, 该信号强度以微阵列上全部的数据点内参均一化处 理, 获得其相对灰度值 nARVOL (normalized ARVOL) . 若信号值小于杂交背景或阵列内两重复点的信号强 度差异在 3 倍以上,则该组信号点被视为无效杂交 点.
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结果与分析
以相同处理的水稻胚乳 RNA 为探针,分别与
2.1 cDNA 微阵列杂交信号的均一性分析 cDNA 微阵列进行 2 次重复杂交试验,然后分别对芯 片间和阵列内各基因的杂交数据进行相关和回归分 析.结果表明,在阵列内每个基因重复点之间的相关 系数均达 0.970 甚至更高, 同一 RNA 探针的不同阵列 之间的相关系数也在 0.965—0.986(图 1).这说明 cDNA 微阵列上基因的重复点之间,以及 2 次重复阵 列杂交之间均具有较高的均一性. 2.2 高温胁迫下水稻胚乳贮藏物代谢相关基因的表 达特征概貌 将芯片杂交后得到与贮藏物代谢相关基因的有效 数据,以高温处理与低温处理之间的杂交信号 (nARVOL)比值(称 R 值)对这些基因对高温胁迫 响应的表达变化进行归类 (表 1) 其中, 值 0.8—1.2 . R 的基因可认为是高温胁迫响应表现比较迟钝的基因, 而 R 值大于 1.2 或小于 0.8 的基因则分别是在高温胁 迫条件呈上调或下调表达响应的差异基因.由表 1 可 见,在 657—673 个相关基因中,R 值在 0.8—1.2 之间 的基因数量最多,在水稻花后的第 5 天,这类型基因 的比例甚至占到检测总基因的 67.6%,它比上调基因 (R>1.2)和下调基因(R≤0.8)的数量总和还要多, 但随高温胁迫处理时间的持续,呈上调(R>1.2)和 下调(R≤0.8)差异表达的基因数量均有所增加(表 1).然而,从 R 值的大小来看,上述差异基因中对 温度处理表现相当活跃的基因(R>2.0 或 R≤0.4)的 所占比例并不高,在水稻开花后的第 20 d,R 值大于 2.0 和小于 0.4 的基因分别只有 52 个和 126 个,也只
reagent , 逆 转 录 酶
dNTP, SUPERSCRIPT Ⅱ为 GIBCO-BRL 公司产品, Taq-DNA 聚合酶和 G-50 柱购于 Promega 公司, α-33P-dCTP 由杜邦公司生产. 1.4 cDNA 微阵列制备 基 于 已 构 建 完 成 的 水 稻 胚 乳 EST 数 据 库 (http://www.estarray.org),用 96 孔板 PCR 扩增了 3 574 个具 3′端 Poly(A+)的非冗余 ESTs 克隆,引物为 M13 通用引物(正向序列 5′-CCCAGTCACGACGTT GTAAAACG-3′,反向序列 5′-AGCGGATAATTTCAC ACAGG-3′).每 100 L 的反应体系包括:1×PCR 缓冲液,1.75 mmolL 的 MgCl2,各 100 ng 的正反向 引物,200 molL 的 dNTP,3 U Taq-DNA 聚合酶和 10 ng 的质粒模板.扩增程序为:94℃预变性 4 min, 每个循环于 94℃下变性 30 s,58℃下退火 60 s,72℃ 下延伸 120 s,共 40 个循环. PCR 产物以等体积的异丙醇沉淀,75%乙醇的洗 盐, 37℃干燥后, 20 L 变性液 加 (0.4 molL NaOH, 10 mmolL EDTA)溶解.将 PCR 产物转移至 384 孔 板,用点样仪(Genomic Solution )以 0.2 mm 的直 径点制于 ImmobilonTM-Ny+尼龙膜(MILLIPORE 公 司产品,8 cm×12.2 cm)上.所有的点点制成 24×16 一级阵,2×5 和 2×4 组合成二级阵,平行 2 次点阵 以验证实验结果的重复性,一级阵和二级阵不足点以
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A:开花后第 5 天;B:开花后第 10 天;C:开花后第 15 天;D:开花后 20 天 A: 5th day after anthesis; B: 10th day after anthesis; C: 15th day after anthesis; D: 20th day after anthesis
图1 Fig. 1
阵列信号值(nARVOL)在 2 次重复杂交间相对应点的散点分布和相关系数
Scattering plots and their correlative coefficients of the normalized AR signal values (nARVOL) between two duplication microarray hybridizations
表1
R值 R value
水稻胚乳贮藏物代谢诸基因对高温胁迫响应的 R 值分类 Classification of R values for their response of various genes involving in endosperm storage metabolism to high temperature
开花后天数 Days after anthesis (d) 5 基因个数 Genes 所占比例 Percentage (%) 0.5 6.3 67.6 21.8 2.8 1.0 100 基因个数 Genes 23 130 213 188 84 29 667 10 所占比例 Percentage (%) 3.5 19.5 31.9 28.2 12.6 4.3 100 基因个数 Genes 35 121 167 149 114 71 657 15 所占比例 Percentage (%) 5.3 18.4 25.4 22.7 17.4 10.8 100 基因个数 Genes 52 125 139 120 99 126 661 20 所占比例 Percentage (%) 7.9 18.9 21.0 18.1 15.0 19.1 100
Table 1
R≤0.4 0.4 3 42 455 147 19 7 673
R 值=高温处理的杂交信号值/适温处理的杂交信号值 R value was the fold-ratio of high temperature to moderate temperature for each expressing gene
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占检测总基因数量的 7.9%和 19.1%.这说明在水稻胚 乳贮藏物代谢相关的诸多基因中,对高温胁迫处理表 现相当敏感的基因数目也是十分有限的. 2.3 高温胁迫下水稻胚乳贮藏物代谢相关基因的表 达谱与表达模式 2.3.1 糖代谢与淀粉合成类基因 图 2 是不同温度 处理下(包括高温和适温)水稻胚乳糖代谢与淀粉合 成类部分基因在开花后不同时期的表达图谱.由图中 的颜色深浅可见,与胚乳糖代谢和淀粉合成相关的各
类不同基因在水稻灌浆过程的表达丰度和变化动态均 存在明显差异.其中,糖代谢路径中的 H015D02(果 糖 激 酶 , fructokinase ) , H023B10 ( 已 糖 激 酶 , hexokinase ) , H063H02 ( 乙 醛 脱 氢 酶 , aldehyde dehydrogenase)H101D05(烯醇酶,enolase)和淀粉 ( H066B09) , 合成路径中的 H028D06 可溶性淀粉合酶, H010D08 ( UDPG- 焦 磷 酸 化 酶 , UDP-glucose pyrophosphorylase),H075G05(ADPG-焦磷酸化酶, ADP-glucose pyrophosphorylase) 以及一些糖信号感应
HT5,HT10, HT15 和 HT20 分别表示高温处理下开花后第 5 天,第 10 天,第 15 天和第 20 天的样品;LT5,LT10,LT15 和 LT20 分别表示适温 处理下开花后第 5 天,第 10 天,第 15 天和第 20 天的样品 HT5, HT10, HT15 and HT20 stand for the samples of 5th , 10th, 15th and 20th days after anthesis at high temperature treatment, and LT5, LT10, LT15 and LT20 for those at low temperature treatment, respectively
Fig. 2
图 2 胚乳糖代谢与淀粉合成类部分基因在不同温度处理下的表达图谱动态 Expression profile of some genes related to carbohydrate metabolism starch synthesis in rice endosperms in two temperature treatments
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因子 H063H02(EREBP-4 like protein,SnRK1)和 H101D05 (糖信号作用蛋白 SnRK1, SnRK1-interacting protein 1 (SnRK1) 等基因在胚乳灌浆前期的表达丰度 要明显高于其灌浆的中后期,而 H121A05(丙酮酸磷 酸激酶, pyruvate phosphate dikinase, PPDK) H048F12 , (苹果酸脱氢酶,malate dehydrogenase),H128G01 (丙酮酸脱氢酶,pyruvate dehydrogenase kinase, PDK),H065B05(淀粉去分支酶,starch debranching enzyme D-glucanohydrolase ) 以 及 与 糖 信 号 有 关 的 H086E03(质子肌醇协同转运体 Hmit,proton myoinositol co-transporter)和 H047H09(ribonucleoprotein -E,snRNP-E)等基因在胚乳灌浆的中后期则表现出 相对较高的表达丰度.此外,胚乳淀粉合成代谢相关 功能基因和有关的糖信号因子对高温胁迫处理的响应 模式也存在较大差异. 其中, H039H08 细胞色素 P450 (
表2
氧化还原酶,cytochrome P450 reductase),H015D02 (果糖激酶,fructokinase,FTK),H023B10(已糖 激酶,hexokinase,HXK),H147C05(β-半乳糖苷酶, beta-galactosidase),H002F11(糖蛋白 25L-2 驱动子, glycoprotein 25L-2 precursor),H151D03(糖信号转 录用因子 LSm7,snRNA-associated Sm-like protein alpha-amylase LSm7) H024G07 α-淀粉酶抑制因子, 和 ( inhibitor ) 等 基 因 在 高 温 下 的 上 调 幅 度 较 大 , 而 H101D05 (糖信号作用蛋白 SnRK1, SnRK1-interacting protein 1)和 H054E10(果糖二磷酸合酶,FBPase-I)等 基因在花后高温下表达信号有较明显的降低.从总体上 看, 发育胚乳中与糖信号有关的基因在不同温度处理下信 号强度变化,要比淀粉合成代谢路径中基因更明显. 从花后高温下胚乳淀粉合成与糖代谢类部分功能 基因的表达模式来看(表 2),这些相关基因在高温
胚乳淀粉合成与糖代谢类的部分功能基因在高温胁迫下的表达模式
Table 2 Expression pattern of some genes related to starch synthesis and carbohydrate metabolism in rice endosperms as affected by high temperature
克隆号 Clone No. H001E09 H066B09 H113C06 H089A07 H033G09 H039E06 H075G05 H028D06 H087F03 H032D10 H039B05 H072H08 H113F07 H065B05 H054E10 H001G10 H015D02 H023B10 H121A05 H045C01 H048F12 H049E09 H063H02 H079B01 H100G12 H101D05 H134F07 H140G02 登录号 Accession No. Q653F4 Q43772 Q43009 P30298 P15280 P55241 P48980 Q43654 Q43846 P19395 Q43093 P27934 Q01401 O64454 P46256 P17784 P37829 Q9SEK3 P11155 Q9AUQ7 Q42972 P12780 Q40255 Q7XHZ2 P26517 Q42971 Q6ZC70 Q43187 调控蛋白注释 Putative gene identification Putative UDP-glucuronyltransferase-l UDP-glucose pyrophosphorylase Sucrose-UDP glucosyltransferase I Sucrose-UDP glucosyltransferase III ADP-glucose synthase (small subunit) ADP-glucose synthase (large subunit) ADP-glucose pyrophosphorylase Soluble starch synthase I Soluble starch synthase III Granule-bound starch synthase I Granule-bound starch synthase II Starch branching enzyme IV Starch branching enzyme I Starch debranching enzyme FBPase,cytoplasmic isozyme-1 FBPase, cytoplasmic isozyme-2 Fructokinase Hexokinase Pyruvate,phosphate dikinase (PPDK) Putative receptor kinase(ppi receiptor) Malate dehydrogenase Phosphoglycerate kinase Aldehyde dehydrogenase Phosphoglucomutase G-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic Enolase Alcoh dehydrogenase Soluble inorganic pyrophosphatase 5 0.983 0.937 0.794 1.424 0.978 1.265 1.131 0.759 1.134 0.729 1.231 1.510 0.994 1.066 0.718 1.197 1.373 1.912 0.613 1.147 1.253 0.812 1.326 1.630 0.816 0.851 1.357 1.005 开花后天数 Days after anthesis (d) 10 0.523 1.136 1.578 0.790 0.881 1.159 0.755 1.894 0.554 1.573 0.652 1.747 0.734 0.612 0.329 2.274 2.604 2.987 0.696 1.678 0.946 1.783 1.879 1.772 0.801 1.599 1.942 1.606 15 0.505 1.725 2.141 0.895 1.233 0.751 0.892 2.314 0.549 1.824 0.718 1.857 0.671 0.703 0.370 1.837 3.770 3.863 0.770 2.458 0.711 1.436 1.723 2.034 0.726 1.344 2.380 0.978 20 0.189 2.252 1.940 0.683 1.195 0.503 0.716 2.070 0.307 1.981 0.858 1.346 0.465 0.562 0.204 2.056 5.256 3.282 0.509 2.390 0.517 1.395 2.097 1.954 0.619 1.522 2.860 1.624
表中数据为高温处理与适温处理之间的基因表达丰度比值(R 值) .下同 The data listed in this table were the fold-ratio of their expression levels between high temperature and low temperature for each expressing gene. The same as below
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胁迫下的上调或下调表现,不仅会随着开花后的时期 差异而有所变化,而且在很大程度上也因其同工型的 种 类 不 同 而 异 . 其 中 , 果 糖 激 酶 ( fructokinase , H015D02),已糖激酶(hexokinase,H023B10),乙 醇脱氢酶(alcoh dehydrogenase,H134F07),丙酮酸 磷酸激酶(PPDK,H121A05),UDPG-葡糖醛酸基 转移酶(UDP-glucuronyltransferase-l,H001E09),可 溶性淀粉合酶(soluble starch synthase,H028D06 和 H087F03),果糖二磷酸合酶(FBPase,H001G10 和 H054E10)淀粉分支酶(starch branching enzyme I, H113F07)等基因在花后高温下的上调或下调幅度相 对较大. 此外, 高温胁迫对 ADPG-焦磷酸化酶 (ADPglucose pyrophosphorylase)的大亚基(H039E06)和 小亚基(H033G09)的调控模式也有所不同,大亚基 在胚乳灌浆后期的下调比较明显. 2.3.2 蛋白合成与蛋白贮藏类基因 高温胁迫对胚 乳蛋白合成和贮藏蛋白类基因的表达调控与基因功能 及类型有关(表 3).谷蛋白,醇溶蛋白和球蛋白等 贮藏蛋白类的相关基因在高温处理下多呈下调表达特 征,尤其是在水稻开花 10 d 后,除醇溶蛋白 PROL-14 组分的前体基因 (H054B10, PRO6_P Prolamin ROL 14 precursor) 谷蛋白 GLU5 组分的前体基因 , (H066D02, GLU5_ORYSA glutelin precursor)和球蛋白 12S 组分 的前体基因(12S storage globulin precursor)之外,多 数贮藏蛋白类基因的下调表现尚较明显.值得关注的 是,蛋白二硫同分异构酶(H132A11,简称 PDI)对 花 后 高温 的响 应 呈上 调表 达 .该 酶是 一 个折 叠酶 (foldase),主要负责贮藏蛋白各亚基的聚合和蛋白 体的形成,可影响各蛋白组分的比例构成和改变谷蛋 白等亚基的聚合度[16].上述现象说明,花后高温不仅 会导致胚乳贮藏蛋白体组分和亚基产生较大改变,同 时也会使其胚乳贮藏蛋白合成代谢的前体基因表达受 到一定抑制. 由表 3 可见,核糖体类蛋白和逆境防御类蛋白的 相关基因在高温处理下呈高丰度或低丰度表达变化的 基因数量相当多,表达差异倍数的差异幅度也相对较 大,对高温胁迫响应的上调或下调表达特征普遍较明 显,尤其是在水稻开花 10 d 后,不少基因在不同温度 处理间的表达差异倍数都超过了 2.0 或低于 0.4, 表明 核糖体蛋白和逆境防御蛋白类基因是水稻发育胚乳中 其中, 对高温处理响应相对敏感的两大主要基因类别. 富甘氨酸蛋白(H019B08),金属硫蛋白(H028D03 和 H011C01),40S 核糖体类蛋白 S9(H105H09)和
S19 (H010H10) 60S 核糖体类蛋白 L35a , (H112C06) 和一些未知功能的蛋白基因 (如, H028B09, H020F06 和 H106H01)等基因在高温处理下均呈特异高表达, 可能是水稻胚乳蛋白合成代谢中最易受高温胁迫诱导 或对高温胁迫响应最敏感的若干基因位点.此外,热 激蛋白和 ABA 响应蛋白在不同温度处理下表达丰度 的差异倍数也很明显,但热激蛋白类基因对高温胁迫 处理的响应表现与热激蛋白的种类有关,在花后高温 下并非一致性的呈上调表达模式.
3
3.1
讨论
胚乳淀粉合成与糖代谢类基因对高温胁迫的响 应表达 淀粉是稻米各种化学组分的主体,占水稻胚乳中
各类贮藏物总量的 80%以上[14].现已基本明确,源器 官合成的光合产物以蔗糖形式运输到胚乳细胞后,继 而经过一系列酶的催化作用形成淀粉[17-18].近年来, 针对灌浆结实期高温导致稻米食用品质不佳的生理原 因,国内外已有不少学者相继利用人工气候箱或大田 温控试验,对不同温度处理下水稻灌浆过程中籽粒淀 粉合成代谢一些关键酶的生理活性差异进行过比较分 析[10,19],但对于有关酶的主要同工型变化及其与温度 处理间的关系目前尚缺乏足够的认识,且相关研究工 作主要局限于少数几个酶(ADPG 焦磷酸化酶,淀粉 合酶, 淀粉分支酶和淀粉去支酶) 的生理活性变化上, 而对不同温度处理下胚乳淀粉合成路径中的蔗糖转 化,淀粉合成过程诸多酶的生理变化及其相关基因的 据 表达特征, 迄今尚缺乏全方位的认识[18]. Jiang 等[11] 和 Keeling 等[20] 报道,在小麦,水稻等作物的籽粒淀 粉合成途径中,可溶性淀粉合酶(SSS)是对花后高 温表现较敏感的一个关键酶,其生理活性变化与籽粒 灌浆速率及淀粉组分间存在着密切联系.但一些学者 也同时提出,淀粉分支酶(Q 酶)或颗粒结合型淀粉 合成酶 (GBSS) 等可能是胚乳灌浆代谢对温度处理感 应的主要酶位点[10,21].李木英等[19]认为,不同温度处 理下水稻的灌浆速率变化与 ADPG 焦磷酸化酶,淀粉 合酶,淀粉分支酶和淀粉去支酶的活性间均存在着显 著的正相关联系.据本文利用 cDNA 微阵列技术对不 同温度处理下水稻胚乳蔗糖转运,淀粉合成代谢类诸 多基因表达特征的检测结果(图 2),果糖激酶,乙 醇脱氢酶,丙酮酸磷酸激酶,UDPG-葡糖醛酸基转移 酶,可溶性淀粉合酶,果糖二磷酸合成酶和淀粉分支 酶等基因在花后高温下的上调或下调幅度均相对较大
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胚乳贮藏蛋白与逆境防御蛋白合成类的部分重要功能基因在高温胁迫下的表达模式
Table 3 Expression pattern of some genes related to carbohydrate metabolism and starch synthesis in rice endosperms as affected by high temperature
类型 Types 贮藏蛋白类 Storage protein 克隆号 Clone No. H148F11 H119C05 H002G04 H013C04 H066D02 H091G06 H109G06 H001H06 H024E06 H001G12 H002C11 H029G09 H095H12 H054B10 H031D10 H008B01 H126H12 H026G03 H014F08 H132A11 核糖体蛋白类 Ribosomal protein H110G02 H105H09 H010H10 H025F04 H026B11 H059A11 H076H05 H112C06 逆境防御蛋白类 Defense protein H013F11 H077F09 H019B08 H011B09 H062E08 H037A04 H028D03 H150B02 H011C01 H063E09 H043D05 H086C09 H126C03 H115G07 H025C11 H084G02 功能未知蛋白 Unknown function protein H025B05 H020F06 H069C08 H028B09 H042F03 H106H01 登录号 Accession No. P07728 P07730 Q09151 P14323 P14614 Q02898 Q02897 P07728 P07729 P15839 P17048 P20696 P19085 P20697 P20698 P12615 P83004 P29835 P15590 P52589 P12146 P46781 P40978 Q67W51 P51425 P45636 P51419 P51422 P40393 Q99069 P49310 P53682 Q656S9 P25070 P94029 Q8GYN5 O64394 Q6YUX5 P27777 P31673 P46254 P33126 Q9Y3C8 Q43468 Q6AVV3 Q7XPU1 Q7XSE8 Q652R5 Q8GS72 Q8H387 调控蛋白注释 Putative gene identification GLU1 Glutelin type A precursor GLU2 Glutelin type A precursor GLU3Glutelin typeA precursor GLU4 Glutelin typeA precursor GLU5 Glutelin typeA precursor GLUB_Glutelin type-B 1 precursor GLUB_Glutelin type-B2 precursor GU11_Glutelin type PREE 61 precursor GU12_Glutelin type I PREE 103 precursor-1 PRO1_10 kDa prolamin precursor PRO2_13 kDa prolamin precursor PRO4_ Prolamin PPROL 4A precursor PRO5_Prolamin PPROL 7 precursor PRO6_Prolamin ROL 14 precursor PRO7_Prolamin PPROL 17 precursor 12S storage globulin precursor 13S storage globulin precursor 19 kDa globulin precursor Globulin-1 S precursor (GLB1-S) Protein disulfide isomerase (PDI) 30S ribosomal protein S3 40S ribosomal protein S9 40S ribosomal protein S19 50S ribosomal protein L35 60S ribosomal protein L39 60S ribosomal protein L10-2 60S ribosomal protein L27 60S ribosomal protein L35a Ras-related protein RIC2 Glycine-rich RNA-binding protein II Glycine-rich RNA-binding protein I Calcium-dependent protein kinase Calcium binding protein-like Calmodulin-related protein 2 Metallothionein-like protein type 2 RPM1-interacting protein Thioredoxin H-type (TRX-H2) ABA-responsive protein 16.9 kDa class I heat shock protein 17.4 kDa class I heat shock protein 22 kDa Heat shock protein 82 kDa Heat shock protein 155 kDa Heat shock protein Heat shock protein STI (GmSTI) OSJNBb0024N19.12 protein OSJNBa0088H09.15 protein OSJNBb0033G08.6 protein Hypothetical protein P0603C10.50 Hypothetical proteinOJ1340_C08.134 Hypothetical protein OJ1513_F02.133 5 0.525 1.246 1.123 0.768 0.911 1.387 1.076 0.802 0.873 0.981 0.876 0.689 1.019 1.580 0.874 1.415 1.093 1.240 0.917 1.184 0.602 1.741 1.257 0.394 1.686 1.244 0.795 1.542 0.961 0.879 1.524 1.326 1.130 1.451 1.916 1.885 1.524 1.508 5.846 1.017 0.751 1.237 0.902 1.814 0.656 2.010 0.631 2. 120 0.664 1.975 开花后天数 Days after anthesis (d) 10 0.378 0.618 0.522 0.856 1.818 0.732 0.587 0.945 0.873 0.418 0.672 0.377 0.563 1.925 0.702 1.283 0.488 0.472 0.395 1.362 0.374 1.869 1.918 0.450 1.711 0.407 0.461 2.119 1.456 0.542 2.301 0.792 0.507 0.842 2.614 2.185 2.519 1.982 3.096 2.346 1.175 0.962 1.951 2.093 0.381 2.653 0.467 3.208 0.274 2.619 15 0.347 0.634 0.329 0.567 2.019 0.643 0.459 0.889 0.714 0.276 0.505 0.272 0.531 2.508 1.853 1.329 0.369 0.622 0.272 1.975 0.290 2.543 1.084 0.615 2.140 0.282 0.480 2.573 2.583 0.555 4.274 0.602 0.511 1.099 4.028 3.169 2.722 1.864 2.371 2.915 0.631 0.716 2. 635 2.507 0.452 4.695 0.241 4.719 0.361 3.506 20 0.284 0.367 0.493 0.193 1.964 0.352 0.403 0.671 0.109 0.236 0.468 0.186 0.442 3.173 1.455 1.207 0.253 0.860 0.404 1.816 0.205 5.648 3.874 0.286 4.115 0.216 0.572 3.811 5.332 0.403 6.238 0.567 0.304 1.227 6.326 5.851 4. 540 2.127 3.288 3.004 0.463 0.674 6.120 2.336 0.126 5.618 0.195 7.396 0.107 5.951
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(表 2).但基因在高温胁迫下的上调或下调表现, 不仅会随着开花后的时期差异而有所变化,而且在很 大程度上也因其同工型的种类不同而异.与最近日本 学者 Yamakawa 等[22]利用水稻开花后第 10 天样品的 cDNA 微阵列检测结果相比,本文结果中的颗粒结合 型淀粉合成酶基因(H032D10),ADPG 焦磷酸化酶 基因 (H075G05) 和蔗糖合成酶的同工型 III (H089A07) 等基因在不同温度条件下的表达差异幅度偏小,而 UDPG-葡糖醛酸基转移酶基因(H001E09),可溶性 淀粉合酶的同工型 III(H087F03)和蔗糖合成酶的同 工型 I(H113C06)等基因的差异表达幅度相对偏大. 此外,一些基因(如,H032D10,H039E06 等)的上 调或下调趋势还与 Yamakawa 等[22]的检测结果存在一 定差异,其原因可能与人工气候箱中的高温胁迫处理 的设定值,供试品种材料的淀粉类型与灌浆结实期长 短等因素差异有关.就试验处理设计而言,本文试验 的高温处理为日均温度 32℃(日最高温 36℃/日最低 温 28℃ , 且 温 度 日 变 化 模 拟 自 然 气 候 特 征 , 而 Yamakawa 等
[22]
以及 13S 和 16 kD 的球蛋白前驱体基因等在高温处理 下的 mRNA 表达量均有不同程度的降低.但与此同 时,负责贮藏蛋白各亚基的聚合和蛋白体形成的蛋白 二硫同分异构酶(H132A11,PDI)却在高温下呈上 调表达特征,有利于胚乳中的各蛋白亚基单元修饰, 聚合或裂解为较完整的贮藏蛋白体.因此笔者推测, 高温处理下稻米中粗蛋白含量上升的原因,除不少学 者认为的"稀释效应"外(高温下淀粉等贮藏物的积 累量降低,导致蛋白质相对含量上升)[4],还与高温 处理下胚乳中各蛋白前体亚基聚合或裂解为完整贮藏 蛋白体及其主要组分的代谢过程有关. 水稻对高温的适应性和胁迫响应往往与胁迫信号 的传导途径紧密相关,并通过有关信号网络对器官中 的糖,氮代谢过程产生调控[27].这一过程中的一个显 著生理变化是,细胞中正常的生理代谢受到抑制,而 转向合成一些与高温胁迫的防卫效应有关蛋白(核糖 体蛋白,膜蛋白,热激蛋白等)[28-29].因而在本文的 芯 片 杂 交 结 果 中 , 部 分 核 糖 体 蛋 白 ( H105H09 , H010H10 和 H112C06),金属硫蛋白(H028D03 和 H011C01)富甘氨酸蛋白(H019B08)和几种热激蛋 白(H043D05,H086C09 和 H025C11 等)在花后高温 处理下的高表达并不令人惊奇.其中,金属硫蛋白具 有抗羟自由基,抗脂质过氧,保护生物膜等功能[28], 而富甘氨酸蛋白为细胞壁结构蛋白[30],并对细胞壁和 细胞膜的损伤具有修复作用.此外,脂类转运蛋白 ( nonspecific lipid-transfer protein, LTP ) 类 基 因 (H002A08,H027H01 和 H047G03 等)在花后不同 温度处理下的表达丰度变化也比较大,但对高温胁迫 的响应在不同亚类间表现不一,甚至呈相反趋势(数 据未列).值得一提的是,Ca++通道传导途径中的一 些重要基因(H011B09 和 H037A04)和 ABA 信号传 导途径中的有关蛋白基因(H063E09)对花后高温处 理的响应也不尽一致.由此可见,花后高温胁迫对水 稻胚乳灌浆贮藏物代谢的调控网络相当复杂,只有借 助更专一的芯片表达技术和基因敲除等手段,才能取 得对高温胁迫下水稻胚乳贮藏物代谢调控网络的较清 晰认识.
则是以昼温 32℃/夜温 28℃作为高温
处理,两者在高温处理的温度值和日温差等方面均有 明显差异,因而上述部分基因在不同试验中的上调或 下调趋势变化也就不难理解.从本文结果看,在水稻 胚乳糖代谢与淀粉合成类的相关基因中,与发育胚乳 中糖信号介导有关的基因[23-24](如,SnRK1,HXK 和 FTK 等)对高温胁迫的感应要比淀粉合成路径中的代 谢基因相对更敏感.因此,进一步对不同温度处理下 水稻胚乳淀粉合成过程的糖信号调控网络变化及其对 高温胁迫的应答机制加以研究,将有助于对高温胁迫 与胚乳淀粉合成代谢间关系的更深入理解. 3.2 胚乳蛋白合成与蛋白贮藏类基因对高温胁迫的 响应表达 蛋白质是水稻籽粒中仅次于淀粉的第二大贮藏物 质,粗蛋白含量的高低和组分变化不仅是稻米营养品 质的一个重要指标,而且对稻米其它品质性状也产生 较大影响
[25-26]
.关于花后高温对水稻籽粒蛋白含量的
[3-4]
影响效应,前人诸多的研究报道已证实,花后高温度 可导致稻米中的粗蛋白含量上升 . 但本研究结果揭 示,与胚乳贮藏蛋白合成代谢直接相关的绝大多数基 因在花后高温胁迫下均呈较大幅度的下调特征.其中 包 括 , 谷 蛋 白 Type-A 和 Type-B 的 前 驱 体 基 因 (H148F11,H109G06 和 H024E06 等),醇溶蛋白主 要组分 13 kD 亚基的前驱体基因(H002C11),醇溶 蛋白中富含硫氨基酸的 10 kD 前体基因(H001G12),
4
结论
在本研究检测的与水稻胚乳贮藏物代谢相关的
657—673 个基因中, 以对高温胁迫响应表现较迟钝的 基因居多,其高温处理与低温处理之间的杂交信号 (nARVOL)比值(称 R 值)大致在 0.8—1.2 之间,
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在水稻花后的第 5 天,这类基因的比例占总检测基因 数量的 67.6%,但随高温处理时间的持续,呈上调或 下调差异表达的基因数量均有明显增加;花后高温对 胚乳糖代谢和淀粉合成类基因表达的调控效应,不仅 随各个基因的功能类型,代谢途径和灌浆进程的差别 变化而异,而且其表达丰度及其上调或下调幅度在很 大程度还与该功能基因的同工型(或酶亚基)变化有 关.与糖信号传导类基因相比,在发育胚乳中的淀粉 合成类和其它糖代谢类的多数基因对高温胁迫的响应 相对较迟钝;高温处理下水稻胚乳中的谷蛋白,醇溶 蛋白和球蛋白类基因多呈下调表达特征, 但也会随其 决定的蛋白亚基组分的不同而异,对胚乳贮藏蛋白的 亚基构成和组分变化产生较大影响;核糖体蛋白和逆 境防御蛋白的相关基因是水稻发育胚乳蛋白合成类基 因中对高温胁迫响应相对敏感的基因类别.其中,富 甘氨酸蛋白,金属硫蛋白,40S 核糖体类蛋白 S9 和 S19,60S 核糖体类蛋白 L35a 等基因在高温处理下均 呈特异高表达.
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(责任编辑 郭银巧)