长片段扩增试剂盒
产品描述:
一般PCR法具有一定的局限性,特别是难以扩增5 kbp以上的长链DNA,这严重限制了PCR法的推广和应 用. 通过改变PCR用DNA聚合酶, PCR用Buffer, PCR扩增条件等, 使长链DNA的扩增成为可能, 这就是LA (Long and Accurate)PCR技术.本试剂盒所用的LA Taq 是Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶,这种混合 酶可以染色体和其它细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应.在人的染色体上可以扩增长度可达27 kb的DNA 片段,而以λDNA为模板则可以扩增出高达40 kb的片段.
产品组成:
ST091 LA Taq(5 U/μl) 10×LA PCR Buffer (2.5mM Mg2+ Plus) 灭菌蒸馏水 Enhancer dNTP Mixture(各10mM) 250U 0.5 ml 4ml 0.4ml 200ul ST092 1250U 2.5 ml 20ml 1.5ml 1ml
举例说明:
按下列组份配制50 μl PCR反应液.
LA Taq(5 U/μl) 10×LA PCR Buffer(Mg2+ Plus) dNTP Mixture(各10 mM) 模板DNA 2.5ng( λphage )或者0.5μg(Human) 噬菌体(0.1-5ng),人基因组(0.1-1μg ) 引物 1(20 μM) 引物 2(20 μM) 灭菌蒸馏水 0.5-1 μl 0.5-1 μl up to 50 μl 0.5 μl-1.0μl 5 μl 2 μl μl
建议循环条件:
步骤 预变性 变性 退火 延伸 变性 退火 温度 94°C 94°C 65°C(视引物 而定) 68°C 94°C 65°C(视引物 而定) 68°C 68°C 时间 1-2分钟 10-20秒 30秒 45-60秒/kb* 10-20秒 30秒 45-60秒/kb+1-20秒 "自动延长"/循环* 10分钟 1 10 循环数目 1
15-20
延伸 最后延伸
扩增大片段尤其是 20kb 以上的片段我们建议 15-30 循环时每个循环的延伸时间要增加 10-15 秒 "自动延长"
时间,如果 PCR 仪器没有"自动延长"功能,那么设定延伸时间时候建议在原有基础上面增加 1-4 分钟. PCR片段长度(kb) 延伸时间(分钟) 3 2 6 4 2 10 7 5 15 10 5 20 14 10 25 17 10 30 20 15 35 24 15 40 27 20 45 30 20
自动延长/循环(秒) 1
注意:
1,10X LA taq buffer PH较高,可能会形成[Mg(OH)2]沉淀,使用前要充分溶解,并Votex保证可能的沉淀
重新溶解,或者37°C温育5分钟,然后Votex充分混匀. 2,扩增长片段强烈推荐使用0.2μl薄壁管.其他试管未经测试.较厚的试管在92℃时不能有效地使模板变 性.变性时,尽可能缩短变性时间,降低变性温度.第一步变性在92~94℃下进行2分钟(GC含量高可延长 时间达5分钟).在循环过程中尽可能缩短变性时间(92~94℃下进行10-15秒),除非模板中富含GC,则95 ℃下变性30秒.这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂,对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时,应该 尽可能的降低变性温度和时间.变性需要的时间在不同的PCR仪器上稍有不同. 3,如果扩增模板GC含量高或者扩增片段比较长,可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%-8%,最常用2% (30kb)往往会改善扩增效果. 4,增长片段引物一般终浓度为0.3-1μM,长度最好为27-36bp,退火温度一般在65℃-70℃,此时退火温度 和延伸温度基本一致,可将退火延伸在同一个温度进行,使用2阶段扩增法.当然如果设计的引物在20bp 左右,则还是使用传统3阶段扩增法为好. 5,模板一般使用0.01-2.5ng(λphage)或者0.1-1μg(Human) 6,1X LA taq buffer中镁离子浓度为2.5mM,建议dNTP浓度为400mM, 然而要得到最佳结果,优化Mg2+的浓 度是必需的.如果含有较高EDTA或者螯合剂,则应该提高Mg2+,如果要增加dNTP浓度,相应也要增加Mg2+ 浓度.