中国农业科学 2005,38(10):2153-2156 Scientia Agricultura Sinica
猪附红细胞体 PCR 检测方法的建立
王 妍 1,张守发 1,刘思国 2,王春来 2
(1 延边大学农学院动物医学系,龙井 133400;2 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,哈尔滨 150001)
摘要:根据已发表的部分猪附红细胞体序列设计了一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增 出了一条约 936 bp 的基因片段,并成功地将该基因克隆于克隆载体 PMD18-T,经酶切分析和 PCR 进一步鉴 定后进行序列测定,结果表明,所克隆的目的基因与 GenBank 中发表的序列一致.并利用特异性引物初步建 立了猪附红细胞体病 PCR 检测技术. 关键词:猪;附红细胞体;克隆;PCR
Establishment of the PCR Method for Detection of Suis Eperythrozoonsis
WANG Yan1,ZHANG Shou-fa1,LIU Si-guo2, WANG Chun-lai2
(1 Veterinary Medicine Department,Agricultural College,Yanbian University,Longjing 133400;2Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001) Abstract :The 16s ribosomal RNA gene of suis eperythrozoon was amplified using gene specific primers from DNA that had been extracted from the blood of infected pig. The 936bp positive product was obtained by PCR and was cloned into the pMD18-T sector. The fragment was sequenced after restriction enzyme analysis and further defined with PCR. The sequence data demonstrated that the complete sequence was similar with the published. PCR assay for identification of eperythrozoonosis was developed. Results show that PCR assay has specificity. Key words: Swine; Eperythrozoon; Cloning; PCR
附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是附红细 胞体(Eperythrozoon)寄生于多种动物和人红细胞 表面及血浆,骨髓内而引起的一种人兽共患病[1]. 有关该病的研究国内还处于血清学研究阶段,普通 镜检和血清学诊断该病还是一种常用的方法
[2~6]
的方法[7~15],而此法用于附红细胞体病的诊断和研 究在国内尚属空白.本试验旨在初步建立 E.suis 的 PCR 检测技术,克隆 E.suis 的部分基因,为进一步 开展 E.suis 基因的表达以及进行该病的早期诊断和 预防奠定一定的基础.
.
而国外针对该病已进行了较为深入的研究.普遍将 血清学试验作为附红细胞体病的定性依据, 1958 年 Splitter 率先将补体结合试验用于诊断猪附红细胞 体病,相继将荧光抗体试验,间接血凝试验,酶联 免 疫 吸 附 试 验 ( ELISA ) 用 于 检 测 附 红 细 胞 体 病
[2~6]
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材料与方法
血液样品采于延边地区不同猪厂,挑取经血液
1.1 病料来源 涂片检测为阳性的 35 份猪血液样品(逐份检查) . 1.2 试剂 酚仿,溶菌酶,蛋白酶 K,Tag DNA 聚合酶, dNTP 均购于上海博亚生物技术有限公司;BamH Ⅰ,HindⅢ和 T4 DNA 连接酶由哈尔滨兽医研究所
.鉴于上述的各种方法存在一定的局限性,
为克服这些方法的缺点,1993 年 Gwaltneys 等人率 先报道了用 PCR 检测猪附红细胞体病, 试验结果显 示, PCR 方法是进行该病诊断和研究的一种有价值

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