本文介绍了利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用(HPLC/MS/MS)测定奶和奶制品中三聚氰胺残留的方法.利用三氯乙酸溶液沉淀蛋白,阳离子交换固相萃取柱净化,进行高效液相色谱-串联质谱分析.经过大量样品分析结果表明,该方法快速,简单,抗干扰能力强,可以作为奶和奶制品中三聚氰胺残留的测定方法.
1 实验部分
1.1 仪器,试剂与材料
Thermo Fisher TSQ Quantum 液相色谱-三重四极杆质谱联用仪,配有电喷雾电离源.
甲醇(色谱纯,德国Merck),乙腈(色谱纯,德国Merck),三氯乙酸,氨水(28%),氢氧化钠(分析纯,南京化学试剂厂),强阳离子交换柱(PCX,60mg 3mL 艾杰尔公司);水为重蒸蒸馏水.
三聚氰胺标准品购买自Sigma-Aldrich公司,纯度≥98%.
液态奶,奶粉,奶油等来自送检样品.
1.2 测定条件
色谱条件:VARIAN C18色谱柱(150 mm×2.1 mm i.d., 5 μm);流动相:10mmol/L醋酸铵水溶液-甲醇(90:10),等度洗脱;流速0.20 mL/min.柱温:室温.进样体积:5μL.分析时间:9 min.
质谱条件:电喷雾离子化,正离子方式检测;毛细管温度350℃;喷雾电压4500 V;.三聚氰胺的质谱条件见表1.
表 1 三聚氰胺质谱条件
Table 1 ESI/MS/MS conditions of melamine
化合物
母离子
(m/z)
子离子
(m/z)
碰撞能量/eV
三聚氰胺
127
85
68
21
15
1.3 标准工作溶液的配制
将三聚氰胺标准用甲醇水(2:8)配制成1.0 g/L的单标储备液,避光冷藏保存.按实际检测需求,用阴性样品提取后吹干,添加一定量的标准溶液和1%三氯乙酸溶液配制相应浓度的标准工作溶液.
1.4 样品前处理
称取(1.00±0.02)g样品于50 mL具塞离心管中,加入1%三氯乙酸溶液10 mL,于液体混匀器上快速混合30 s,超声波仪超声30min.离心5 min(8000 r/min),将上层清液过滤纸到干净离心管中,待净化.用3 mL甲醇,3 mL水分别活化强阳离子交换柱,将滤液上柱,3 mL水和3mL甲醇洗涤SPE小柱,3 mL氨水甲醇(5% V:V)洗脱后,40℃水浴旋转蒸发至干.用1.0 mL 三氯乙酸溶液(1%)定容后,过滤膜到进样瓶中,供液质联用仪测定.
2 结果与讨论
2.1 提取和净化条件的选择和优化
三聚氰胺极性较强,因此提取溶剂一般都使用极性较强的体系:缓冲水溶液,极性较强的有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂.实验中比较了甲醇,甲醇水混合溶剂(1:1),乙腈,乙腈水混合溶剂(1:1),水,1%三氯乙酸水溶液和5 %三氯乙酸水溶液作为提取溶剂,在阴性液态奶,奶粉,奶油中添加0.5 mg/kg浓度的三聚氰胺标准,比较不同提取溶剂的提取效果.
结果发现纯有机溶剂直接提取回收率低,其余溶剂提取效率接近.在大量实际样品分析中发现,有一些奶粉样品在使用水或有机和水混合溶剂提取后,十分粘稠,高速离心后亦无法过滤或过滤困难,且某些定容样品溶液在放置2hr后出现沉淀,极容易导致色谱分析柱或分析预柱堵塞.1%三氯乙酸溶液可以沉淀样品中的蛋白,避免该类现象的出现.在实验中,5%和10%的三氯乙酸也曾经作为提取溶剂来使用,增加三氯乙酸的含量沉淀蛋白的效果更加明显,但是随着提取溶剂中三氯乙酸的含量的增加,对色谱分析中色谱峰形产生较大影响或者有不出峰的现象.最终选择1%三氯乙酸溶液作为提取溶剂使用.
由于出口奶和奶制品成份复杂,直接三氯乙酸提取后高效液相色谱-串联质谱测定时,容易出现离子源喷口污染比较严重导致灵敏度下降的现象,需要对样品进行净化.三聚氰胺结构中含有三个伯胺基团,属于碱性化合物,在酸性条件下形成正离子,可以采用强阳离子固相萃取柱对样品进行净化,通过水和甲醇的清洗可以除去样品中水溶性的杂质,无机盐和非离子化的脂溶性杂质[9].实验中发现利用强阳离子交换柱对样品进行净化后,可以较大限度的去除杂质,经过大量样品的分析,依然可以有效的防止样品过脏导致喷口污染的情况发生.
2.2 色谱和质谱条件的优化
三聚氰胺属于强极性化合物,在C18色谱柱上几乎无保留,导致三聚氰胺与干扰物质无法分离,对检测带来干扰.为增加三聚氰胺在C18色谱柱上保留,HPLC-DAD分析中一般都在流动相中加入离子对试剂,如庚烷磺酸钠,辛烷磺酸钠[8] 和十二烷基磺酸钠等,与三聚氰胺形成中性离子对.在HPLC/MS/MS测定中,流动相中只能使用挥发性的离子对试剂,如七氟正丁酸[6].但是七氟正丁酸的使用,尽管可以改善三聚氰胺在普通C18柱上的保留,但其会导致负离子无法正常测定,一般不建议使用,所以直接采用90:10的醋酸铵水溶液-甲醇作为流动相.

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